一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113832253A(43)申请公布日2021.12.24(21)申请号202111315550.9G16B20/00(2019.01)(22)申请日2021.11.08G16B20/30(2019.01)C12R1/645(2006.01)(71)申请人沈阳农业大学地址110866辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号(72)发明人战宗祥朴钟云李晓楠张宇飞郭玲玲(74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所(普通合伙)11491代理人张国栋(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12N1/14(2006.01)C12Q1/6806(2018.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图2页(54)发明名称一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法(57)摘要本发明公开了一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，是对对大白菜亲本进行自交后构建F2群体，接种后进行根肿病表型鉴定。针对F2群体表型鉴定结果分析了该试验抗根肿病材料的遗传规律，通过构建抗感病植株混池，SSR标记的筛选，构建出遗传图谱和物理图谱，并对试验材料中含有的抗病基因进行了初步定位。CN113832253ACN113832253A权利要求书1/2页1.一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)在大白菜根部接种根肿菌，接菌六周后进行抗病性调查，根肿病发生部位在根部，将洗好的植株依据抗病性调查分级标准对各植株进行分级并观察记录，其中抗病性调查分4个等级，0级为根部无瘤，1级为主根无瘤、须根和侧根部分有少量小瘤，2级为主根有小瘤、侧根有较大瘤，3级为主根和侧根都膨大、并且主根瘤较大，0级和1级作为抗病植株，2级和3级为感病植株；(2)以对大白菜抗病植株和感病植株为亲本进行自交后获得大白菜植株的F2群体，对F2群体植株进行DNA的提取，利用分离群体混合分析法，从F2群体中将20个抗病植株和20个感病植株进行等量DNA混合，构建抗病混池与感病混池，根据抗根肿病的目标性状，选择该性状分离的F2群体中极端子代做成混池DNA，利用重测序方法进行建库测序，筛选出与大白菜抗病性状相关的候选区域；(3)在F2群体中，依据分离群体混合分析法所确定本抗病植株中抗病位点位于的染色体位置，根据该染色体已发表的抗病位点，利用已发表抗根肿基因连锁的标记进行验证并开发标记，筛选出具有亲本多态性的标记；(4)对大白菜抗根肿病的田间鉴定结果数据进行描述性统计分析，根据在亲本中筛出的具有多态性的标记引物，对F2群体中单株进行基因型鉴定，根据分离群体混合分析法的测序结果和抗病亲本与感病亲本筛选出10对具有多态性标记的植株，使用4对多态性标记的植株对F2群体进行基因型验证；依据抗病性性鉴定的表型和使用分子标记鉴定的基因型结果，使用6对具有多态性标记的植株对筛出的重组体进行基因型验证，使用JoinMap4.0软件，将出现严重缺失数据的标记删掉，默认LOD值为2.0，进行遗传连锁图谱的绘制，使用MapChart软件绘制遗传物理图谱。2.根据权利要求1所述一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，其特征在于，上述步骤(1)中，根肿菌菌液的制备方法如下：(1)称取新鲜或解冻的根瘤20g，用灭菌手术刀将根瘤切成1cm方块，放入250ml烧杯中，向烧杯中加入灭菌蒸馏水100ml，得到悬浮液；(2)匀浆机5000rpm/min粉碎根瘤2‑3min，医用纱布折叠8层，覆盖在250ml烧杯中；(3)将步骤(1)烧杯中悬浮液经步骤(2)所准备的8层纱布过滤，滤液摇匀后用移液器取2μl放入1.5ml离心管，灭菌蒸馏水稀释100倍，摇匀后取稀释后菌液再次稀释10倍后用血细胞计数板计算浓度；(4)依据滤液浓度用蒸馏水稀释至接菌所需浓度1×107个孢子/ml，得到根肿菌菌液。3.根据权利要求2所述一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，其特征在于，大白菜根部接种根肿菌前，根肿菌菌液于4℃下放置5‑10小时，每颗大白菜接种根肿菌菌液的量为1mL。4.根据权利要求1所述一种大白菜根肿病抗性基因的定位方法，其特征在于，上述步骤(2)中，对F2群体植株进行DNA的提取的具体操作为：(1)对植株叶片的幼嫩部分进行采样，采样前对植株进行编号，在离心管上写好编号备用，将采取0.5g的新鲜叶片放入写好对应植株号码的2.0ml离心管中，放入干净的钢珠于离心管内盖好离心管，将采好的叶片保存备用；(2)提取DNA前设置恒温水浴锅于65℃，待水温达到后将配置好的质量分数为2％的十2CN113832253A权利要求书2/2页六烷基三甲基溴化铵水溶液于恒温水浴锅中进行预热处理，使其充分溶解；(3)取出装有叶片的离心管，快速用液氮进行冷冻处理，迅