表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114107226A(43)申请公布日2022.03.01(21)申请号202111249164.4C12N15/40(2006.01)(22)申请日2021.10.26C12N15/861(2006.01)C12N15/66(2006.01)(71)申请人中国农业科学院哈尔滨兽医研究所A61K39/295(2006.01)（中国动物卫生与流行病学中心哈A61K39/235(2006.01)尔滨分中心）A61K39/12(2006.01)地址150009黑龙江省哈尔滨市南岗区马A61P31/14(2006.01)端街427号A61P31/20(2006.01)(72)发明人潘青王笑梅高玉龙祁小乐A61P9/00(2006.01)崔红玉刘爱晶刘长军张艳萍A61P1/16(2006.01)李凯高立C12R1/93(2006.01)(74)专利代理机构北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139代理人马鑫(51)Int.Cl.C12N7/01(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表1页附图5页(54)发明名称表达vvIBDV-VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种表达vvIBDV‑VP2蛋白的重组4型禽腺病毒活载体疫苗株及其构建方法和应用。本发明在血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20的基础上，在FAdV‑4基因组开放阅读框42和43之间的长度为1966‑bp天然核苷酸缺失位点插入传染性法氏囊病病毒超强毒的VP2基因，获得了一种表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV‑4)活载体疫苗株，命名为rHN20‑vvIBDV‑VP2。免疫保护实验证明，免疫rHN20‑vvIBDV‑VP2的SPF鸡可以完全抵抗FAdV‑4强毒株以及IBDV超强毒株的攻毒感染，说明rHN20‑vvIBDV‑VP2具有非常好的免疫原性，可以作为防治鸡心包积液‑肝炎综合征以及鸡传染性法氏囊病的活载体疫苗毒株。CN114107226ACN114107226A权利要求书1/2页1.表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV‑4)疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是在血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rHN20的基础上，在FAdV‑4基因组开放阅读框42和43之间的长度为1966‑bp天然核苷酸缺失位点插入传染性法氏囊病病毒超强毒的VP2基因获得的，其中所述的FAdV‑4反向遗传疫苗株rHN20是通过反向遗传技术将我国新发毒株HLJFAd15的Hexon基因替换为天然弱毒株ON1的Hexon基因而获得。2.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV‑4)疫苗株，其特征在于，所述的传染性法氏囊病病毒超强毒为传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ‑0504，其NCBI登录号为GQ451330.1。3.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV‑4)疫苗株，其特征在于，传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ‑0504VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1‑4任一项所述的表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒(FAdV‑4)疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过以下方法构建得到的：(1)vvIBDV‑VP2表达盒质粒(CMV‑VP2)的构建以传染性法氏囊病病毒超强毒HLJ‑0504cDNA为模板，使用引物VP2F:ttagtgaaccgtcagatccgctagcgccaccATGACAAACCTGCAAGATCAAACC和VP2R:ctgattatgatctagagtcgcggccgctttaCCTTAAGGCCCGAATTATGTC扩增VP2基因编码区，回收PCR产物；将pEGFP‑N1用NheI和NotI限制性内切酶进行双酶切，回收较大片段；将PCR产物与酶切后的载体大片段用ClonExpressIIOneStepCloningKit进行重组连接，转化至DH5α感受态中，涂板，获得重组质粒，将测序正确的质粒命名为CMV‑VP2；(2)Fos‑rHN20‑vvIBDV‑VP2感染性克隆粘粒的构建使用Counter‑SelectionBACModificationKit构建Fos‑rHN20‑vvIBDV‑VP2感染性克隆粘粒，方法如下：首先将Fos‑rHN20电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter‑SelectionBACModif