一种双子叶植物多基因编辑载体及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114438123A(43)申请公布日2022.05.06(21)申请号202210217286.3A01H5/00(2018.01)(22)申请日2022.03.07A01H6/82(2018.01)(71)申请人中量大黄山高质量发展研究院有限公司地址242700安徽省黄山市黄山高新技术产业开发区梅林大道99号(72)发明人李喜凤朱诚吕巧巧李协徐芳卿菁(74)专利代理机构北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙)11463专利代理师王闯(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N5/10(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表3页附图6页(54)发明名称一种双子叶植物多基因编辑载体及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种双子叶植物多基因编辑载体及其构建方法，涉及基因工程和生物技术技术领域。多基因编辑载体包括启动sgRNA的编码DNA转录的启动子、靶片段sgRNA转录的表达框、Cas9蛋白的表达框。本发明提供的多基因编辑载体利用OverlappingPCR结合酶切连接的方法将多个gRNA序列连接至已有Cas9序列的表达载体上，进而可以通过农杆菌侵染等转基因技术获得植物多突变体。利用这种OverlappingPCR结合酶切连接的构建策略，可以组合多个gRNA，通过一次转基因就可获得植物多突变体，从而建立了一种高效、便捷制备植物多突变体的方法。CN114438123ACN114438123A权利要求书1/2页1.一种双子叶植物多基因编辑载体，其特征在于，所述多基因编辑载体包括启动sgRNA的编码DNA转录的启动子、靶片段sgRNA转录的表达框、Cas9蛋白的表达框；所述启动sgRNA的编码DNA转录的启动子为AtU6和/或AtU3；所述双子叶植物多基因编辑载体是采用OverlappingPCR分别向所述启动子和非靶片段sgRNA中连入带有酶切位点的接头，经酶切后连接获得启动子‑非靶片段sgRNA载体；然后分别将靶片段sgRNA和酶切后的启动子‑非靶片段sgRNA载体连接，获得带有靶片段sgRNA转录的表达框的中间载体；分别将多个带有靶片段sgRNA转录的中间载体酶切后连接获得启动子调控的多元载体；然后利用限制性内切酶切割形成不同粘性末端将所述多元载体上的多个启动子调控的靶片段sgRNA连接至带有Cas9蛋白的表达框的载体中。2.根据权利要求1所述的双子叶植物多基因编辑载体，其特征在于，所述靶片段sgRNA转录的表达框为T1‑sgRNA、T2‑sgRNA和T3‑sgRNA中的至少两个，所述T1‑sgRNA、T2‑sgRNA和T3‑sgRNA的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1‑3所示。3.根据权利要求2所述的双子叶植物多基因编辑载体，其特征在于，所述启动sgRNA的编码DNA转录的启动子选自AtU6‑1、AtU6‑26和AtU3b中的至少两种；所述AtU6‑1、AtU6‑26和AtU3b的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4‑6所示。4.根据权利要求1所述的双子叶植物多基因编辑载体，其特征在于，所述Cas9蛋白的表达框包括：标签序列、核定位序列、Cas9蛋白编码序列和Cas9蛋白启动子序列；所述标签序列选自c‑myc、FLAG、V5、His、T7或HSV；优选地，所述Cas9蛋白的表达框还包括荧光标记蛋白；优选地，所述Cas9蛋白的编码序列如SEQIDNO.7所示；优选地，所述Cas9蛋白启动子序列选自下组：AtU6‑1、AtU3b、AtU3d、AtU6‑29、Actin、35S、Ubi、UBQ、SPL、CmYLCV和组织特异性启动子YAO、CDC45、rbcS、诱导型启动子XEV或其组合。5.根据权利要求4所述的双子叶植物多基因编辑载体，其特征在于，所述带有Cas9蛋白的表达框的载体为带有Cas9蛋白的表达框的农杆菌载体；优选地，所述农杆菌载体选自重组pCAMBIA1300、重组pCAMBIA1301或重组pRI101‑AN；优选地，所述重组pCAMBIA1301载体是将去除PMD18T的AtU6‑26启动子之后的载体经酶切连接获得的重组pCAMBIA1301载体；优选地，所述双子叶植物选自茄科、豆科、葫芦科、十字花科、锦葵科或蔷薇科；优选地，所述茄科选自番茄。6.一种双子叶植物基因组编辑的系统，其特征在于，其包括权利要求1‑5任一项所述的双子叶植物多基因编辑载体。7.一种宿主细胞，其特征在于，包含有如权利要求1‑5任一项所述的双子叶植物多基因编辑载体或如权利要求6所述的双子叶植物基因组编辑的系统；优选地，所述宿主细胞为双子叶植物细胞。8.一种如权利要求1‑5任一项所述的双子叶植物多基因编辑载体的构建方