一种猪A型塞内卡病毒中和性抗体、竞争ELISA检测试剂盒及检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114675024A(43)申请公布日2022.06.28(21)申请号202210205821.3(22)申请日2022.03.03(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730000甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号(72)发明人孙普马雪青卢曾军付元芳黄嘉馨李坤李冬宋雅丽李平花张婧包慧芳曹轶梅赵志荀王健白兴文刘在新(74)专利代理机构兰州智和专利代理事务所(普通合伙)62201专利代理师赵立权(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)权利要求书2页说明书11页附图6页(54)发明名称一种猪A型塞内卡病毒中和性抗体、竞争ELISA检测试剂盒及检测方法(57)摘要本发明提供了一种猪A型塞内卡病毒中和性抗体，利用上述抗体制备的SVA竞争ELISA检测试剂盒及相应检测方法，所述检测试剂盒包括：包被有猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M5并捕获抗原的反应板，生物素标记的猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M25，阳性对照血清，阴性对照血清，血清稀释液，底物溶液，终止液，洗涤液。本发明利用SVA中和性抗体用于ELISA检测，相比SVA特异性抗体，中和性抗体更能准确反应SVA感染或者疫苗免疫水平；且本发明试剂盒和检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性；检测操作简便，检测周期短，单次检测时间约为90min。CN114675024ACN114675024A权利要求书1/2页1.一种猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M5，其特征在于，所述单克隆抗体1M5包括如下轻链和重链可变区氨基酸序列：1M5抗体轻链:ATMAWTVLLIGLLAVGSGVDSQTVIQEPAMSVSLGGTVTLTCAFSSGSVTTNNYPRWFQQTPGQPPRQLIYQTNSRPTGVPSRFSGAISGNKATLTITGAQAEDEADYFCALYTSPATVFGGGTHLTVLGQPKAAPTVNLFPPSSEELGTNK1M5抗体重链:ATMEFRLNWVVLFALLQGVQGEEKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTFSSTRINWVRQAPGKGLEWLASISTDGGITGYTDSVKGRFTISRDNSQNTAYLQINSLRSEDTARYYCATGCASGCGGYWGWGPGVEVV。2.一种猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M25，其特征在于，所述猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M25包括如下轻链和重链可变区氨基酸序列：1M25抗体轻链:ATMAWTVLLIGLLAVGSGVDSQTVIQEPAMSVSLGGTVTLTCAFSSGSVTSSNYPGWFQQTPGQPPRTVIYSTKNRPTGVPSRFSGAISGNKATLTITGAQAEDEADYFCAMDKGSGTYIVLFGGGTHLTVLGQPKAAPTVNLFPPSSEELGTNK1M25抗体重链:ATMEFRLNWVVLFALLQGVQGEEKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSSYDVEWVRQAPGKGLEWLAYTDFSGTDTYYADSVKGRFTISRDNSQNTAYLQMNSLRTEDTARYYCETGGFRSCVGSGCSLWGPGVEVVV。3.一种猪A型塞内卡病毒中和性抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：包被有猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M5并捕获抗原的反应板，生物素标记的猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M25，阳性对照血清，阴性对照血清，血清稀释液，底物溶液，终止液，洗涤液。4.根据权利要求3所述的一种猪A型塞内卡病毒中和性抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述反应板的制备过程如下：（1）包被：用碳酸盐缓冲溶液稀释猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M5至终浓度2μg/mL，然后加入酶标板中，每孔100μL，封口膜封口后于2‑8℃条件下过夜包被；（2）捕获抗原：PBST溶液洗涤酶标板3次后，将猪A型塞内卡病毒抗原使用PBS溶液稀释至0.5μg/mL，按100μL/孔加入酶标板中，置于室温下孵育2h，然后用PBST溶液洗涤酶标板3次；（3）封闭：用含2%BSA和5%蔗糖的PBST溶液作为封闭液，按100μL/孔加入，置于室温下孵育1h或者2‑8℃过夜，PBST溶液洗涤酶标板3次，吸干残液，吹干酶标板后，加干燥剂密封，即为试剂盒反应板；所述试剂盒反应板于2‑8℃冷藏保存，每个试剂盒配装两块反应板。5.根据权利要求3所述的一种猪A型塞内卡病毒中和性抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的猪A型塞内卡病毒中和性单克隆抗体1M25的制备过程如下：（1）使用截留量100KDa的超滤管将猪A型塞