一种利用基因编辑技术创制高类胡萝卜素甜玉米的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114703224A(43)申请公布日2022.07.05(21)申请号202210370248.1A01H6/46(2018.01)(22)申请日2022.04.09(71)申请人吉林省农业科学院地址130033吉林省长春市生态大街1363号(72)发明人宋广树吕庆雪周迎鑫孙蕾周德龙(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465专利代理师田立媛(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/54(2006.01)A01H5/00(2018.01)权利要求书2页说明书11页序列表9页附图2页(54)发明名称一种利用基因编辑技术创制高类胡萝卜素甜玉米的方法(57)摘要本发明公开了一种利用基因编辑技术创制高类胡萝卜素甜玉米的方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种利用基因编辑技术创制高类胡萝卜素甜玉米的方法，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmSu1、ZmIsa2、ZmIsa3和ZmZpu1基因同时进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因突变片段的突变体材料，这些籽粒变甜、类胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。CN114703224ACN114703224A权利要求书1/2页1.一种利用基因编辑技术创制高类胡萝卜素甜玉米的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)针对基因Zmsu1、ZmIsa2设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：Zmsu1：5’‑GCCTTTGATGAACTGACGCACGG‑3’；SEQIDNO.5；和ZmIsa2：5’‑GCGGAGATACGGACACACCGCGG‑3’；SEQIDNO.6；(2)以pCBC‑MT1T2质粒为模板，MT1T2‑F，MT1T2‑F0，MT1T2‑R0，MT1T2‑R为引物，PCR扩增目的片段；所述引物序列如下：MT1T2‑F：5’‑AATAATGGTCTCAGGCGCCTTTGATGAACTGACGCA‑3’；SEQIDNO.7；MT1T2‑F0：5’‑GCCTTTGATGAACTGACGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC‑3’；SEQIDNO.8；MT1T2‑R0：5’‑CGGTGTGTCCGTATCTCCGCGCTTCTTGGTGCC‑3’；SEQIDNO.9；MT1T2‑R：5’‑ATTATTGGTCTCTAAACCGGTGTGTCCGTATCTCCG‑3’；SEQIDNO.10；(3)针对基因ZmIsa3、ZmZpu1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA作用位点；所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为：ZmIsa3：5’‑ACCACGACGAAAGTTCAGAGCGG‑3’；SEQIDNO.11；和ZmZpu1：5’‑TGGTCAGACTGAGAACAGCGCGG‑3’；SEQIDNO.12；(4)以pCBC‑MT1T2质粒为模板，MT1T2‑F’，MT1T2‑F0’，MT1T2‑R0’，MT1T2‑R’为引物，PCR扩增目的片段；所述引物序列如下：MT1T2‑F’：5’‑AATAATGGTCTCAGGCGCCACGACGAAAGTTCAGAG‑3’；SEQIDNO.13；MT1T2‑F0’：5’‑GCCACGACGAAAGTTCAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC‑3’；SEQIDNO.14；MT1T2‑R0’：5’‑CGCTGTTCTCAGTCTGACCCGCTTCTTGGTGCC‑3’；SEQIDNO.15；MT1T2‑R’：5’‑ATTATTGGTCTCTAAACCGCTGTTCTCAGTCTGACC‑3’；SEQIDNO.16；(5)将步骤(2)和步骤(4)获得的目的片段分别与载体pBUE411进行酶切连接，分别构建得到Zmsu1、ZmIsa2基因编辑载体pBUE411‑2gR‑Zmsu1‑ZmIsa2和ZmIsa3、ZmZpu1基因编辑载体pBUE411‑2gR‑ZmIsa3‑ZmZpu1；(6)将步骤(5)获得的基因编辑载体pBUE411‑2gR‑Zmsu1‑ZmIsa2和pBUE411‑2gR‑ZmIsa3‑ZmZpu1分别单独转入农杆菌LBA4404，进行玉米遗传转化，获得pBUE411‑2gR‑ZmSu1‑ZmIsa2载体阳性植株和pBUE411‑2gR‑ZmIsa3‑ZmZpu1载体阳性植株；经杂交和自交以及筛选鉴定获得类胡萝卜素含量高的甜玉米材料。2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术创制高类胡萝卜素甜玉米的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增反应体系为：pCBC‑MT1T2质粒1μl，MT1T2‑F0.5μl，MT1T2‑F00