一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114807219A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210394766.7(22)申请日2022.04.15(71)申请人河南省农业科学院芝麻研究中心地址450000河南省郑州市金水区花园路116号(72)发明人张海洋琚铭苗红梅黄盈盈段迎辉韩秀花马琴穆聪(74)专利代理机构郑州联科专利事务所(普通合伙)41104专利代理师张晓萍(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)A01H6/66(2018.01)A01H5/00(2018.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表1页附图1页(54)发明名称一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法(57)摘要本申请属于基因工程操作技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法。该方法包括：获得外植体、制备侵染液、侵染共培养、组织培养、抗性筛选、诱导生根和移栽等步骤。本申请以常用的农杆菌侵染子叶进行转基因方法为基础，结合芝麻组培再生体系的构建，提供了一种具有转化周期短、转化率高的基于芝麻子叶的转基因遗传转化方法。初步实验结果证实，相关植物添加物对实现芝麻再生植株健康生长和生根是必备条件，而通过相关培养基组分和培养条件的优化组合，可成功获得大批芝麻转基因植株。基于该遗传转化体系，可为后续开展芝麻重要基因功能验证、转基因突变体库构建及优异种质创制等研究奠定良好的技术基础。CN114807219ACN114807219A权利要求书1/2页1.一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，该方法包括如下步骤：（一）获得外植体对芝麻种子消毒后，培养萌发，以子叶作为转基因用外植体材料；（二）制备侵染液，并进行侵染共培养在将带有目的基因的重组质粒转化农杆菌后，将转化正确的重组农杆菌活化、培养，并制备成侵染菌液；将步骤（一）中所获得外植体材料置于侵染菌液中浸染8~20min；取出浸染后外植体材料，黑暗条件下共培养2~4d；（三）组织培养和进行抗性筛选将步骤（二）中共培养后外植体转入诱导培养基中，以诱导形成丛生芽；随后，将诱导出的丛生芽分切后转接至抗性筛选培养基中，进行抗性筛选，并将筛选所得幼苗培养至生长有2‑4片真叶的幼苗；培养期间，所述抗性筛选培养基，培养基中添加有：植物添加物5.0~10.0g/L；所述植物添加物，为特油作物芝麻和/或紫苏叶片；（四）诱导生根和移栽对步骤（三）中抗性筛选所得到组培幼苗，进一步分切后或者直接转入生根培养基中，继续培养以诱导生根；待生根后幼苗主根长至不短于3cm时，可移栽至营养钵中进行适应性驯化，驯化5~7d后移至温室或大田进行种植。2.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，步骤（一）中，所述芝麻的芝麻品种为豫芝11号；所述转基因用外植体材料指芝麻种子萌发后靠近尖部1/3处的子叶组织。3.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，步骤（二）中，侵染菌液中，农杆菌浓度为OD=0.60.8；600~制备侵染液时，以液体共培养基M1重悬农杆菌菌体制备获得；共培养时，采用固体型共培养基M1进行培养；所述液体共培养基M1，其配方为：MS+6‑BA5.0mg/L+IAA1.0mg/L+ABA1.0mg/L+AgNO35.0mg/L+乙酰丁香酮100mmol/L，pH=5.8；所述固体型共培养基M1，其配方为：液体共培养基M1+琼脂粉7.5g/L。4.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，步骤（三）中，诱导形成丛生芽时，诱导培养基M2配方为：MS+6‑BA5.0mg/L+IAA1.0mg/L+ABA1.0mg/L+AgNO35.0mg/L+头孢氨苄400mg/L+琼脂粉7.5g/L，pH=5.8。5.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，步骤（三）中，抗性筛选时，抗性筛选培养基M3配方为：MS+6‑BA2.5mg/L+IAA1.0mg/L+ABA1.0mg/L+AgNO5.0mg/L+头孢氨苄300mg/L+抗性筛选物+植物添加物5.010.0g/L+琼3~脂粉7.5g/L，pH=5.8。6.如权利要求5所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，所述抗性筛选物，针对pBI121质粒，为20mg/L的卡那霉素；针对pFGC5941质粒，为草铵膦1mg/L。2CN114807219A权利要求书2/2页7.如权利要求1所述农杆菌介导的芝麻子叶转基因方法，其特在于，步骤（四）中，所述生根培养基，其配方为：MS+NAA2.0mg/L+头孢氨苄200mg/L+植物添加物5.0g/L+琼脂粉7.5g/L，pH=5.8。3CN114807219A说明书1/9页一种农杆菌介导的芝麻子叶转基因方