一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114854698A(43)申请公布日2022.08.05(21)申请号202210682771.8C12N15/66(2006.01)(22)申请日2022.06.16A61K39/135(2006.01)A61P31/14(2006.01)(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所C12R1/93(2006.01)地址730046甘肃省兰州市城关区徐家坪1号(72)发明人李平花卢曾军查晶晶马雪青孙普李冬白兴文曹轶梅李坤袁红付元芳包慧芳刘在新赵志荀王健张克强陈应理张强(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师薛红凡(51)Int.Cl.C12N7/01(2006.01)C12N15/85(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表5页附图3页(54)发明名称一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供了一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用，属于生物制品技术领域。本发明通过口蹄疫病毒的反向遗传操作技术，在嵌合口蹄疫病毒O/XJ/CHA/2017株主要免疫基因重组病毒骨架上，进一步用口蹄疫病毒O/NXYCh/CHA/2018株的G‑H环基因替换其对应基因，构建的重组病毒rHN/XJ/NXGH引起100％致感染细胞病变的时间显著缩短到12h，感染细胞12h的复制滴度提高了5倍以上。重组病毒连续传代，遗传稳定性良好，且G‑H环的替换没有影响疫苗的免疫原性。因此，本发明提供的重组口蹄疫病毒株rHN/XJ/NXGH有潜力作为疫苗候选株，用于我国O型口蹄疫的有效防控。CN114854698ACN114854698A权利要求书1/1页1.一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株，其特征在于，以重组口蹄疫病毒rHN/XJ为骨架，嵌合了O/NXYCh/CHA/2018毒株的G‑H环抗原表位基因所得；所述重组口蹄疫病毒rHN/XJ是以口蹄疫疫苗毒株O/HN/CHA/93为骨架，嵌合流行毒株O/XJ/CHA/2017的L+P1基因所得。2.根据权利要求1所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株，其特征在于，所述O/NXYCh/CHA/2018毒株的G‑H环抗原表位基因的核苷酸序列如SEQIDNO：4。3.根据权利要求1所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株，其特征在于，O/XJ/CHA/2017毒株的L+P1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2。4.权利要求1～3任意一项所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以O/HN/CHA/93毒株半长质粒pSK‑Z123为骨架，人工合成含口蹄疫病毒O/XJ/CHA/2017株L+P1基因的重组载体，得到pSK‑Z123XJLP1重组质粒；2)以步骤1)中所述pSK‑Z123XJLP1重组质粒为骨架，嵌合入O/NXYCh/CHA/2018毒株的G‑H环基因，得到pSK‑Z123XJLP1/NXGH；3)用SpeⅠ和BglⅡ消化步骤2)中所述pSK‑Z123XJLP1/NXGH，得到酶切片段；4)将所述酶切片段克隆至pOFS质粒中，得到PQSE；5)将步骤4)中所述PQSE转染细胞，拯救病毒，得到rHN/XJ/NXGH。5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤3)所述SpeⅠ和BglⅡ消化的体系：10×BufferH10μL、BglⅡ4μL、SpeⅠ4μL、重组质粒4μg，ddH2O补充至100μL；酶切体系为在37℃条件下孵育1h～2h。6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤4)所述pOFS质粒的克隆位点为SpeⅠ/BglⅡ。7.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤4)所述克隆后，还包括对PQSE进行鉴定；所述鉴定的方法为采用PstI酶对所述重组质粒PQSE进行酶切，酶切出838bp，4250bp和6050bp三个条带，初步说明重组质粒PQSE大小正确，然后对酶切鉴定正确的重组质粒PQSE进行测序分析，结果表明重组质粒PQSE是在嵌合有O/XJ/CHA/2017毒株L+P1基因的骨架上，替换了O/NXYCh/CHA/2018毒株G‑H环基因。8.权利要求1～3任意一项所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株或权利要求4～7任意一项所述构建方法得到的O型口蹄疫病毒株在制备防控口蹄疫的疫苗中的应用。9.一种防控口蹄疫的疫苗，其特征在于，包括佐剂和权利要求1～3任意一项所述复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株或权利要求4～7任意一项所述构建方法得到的O型口蹄疫病毒株。2CN114854698A说明书1/9页一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种复制滴度提高的O型口蹄疫病毒株及其构建