基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114891759A(43)申请公布日2022.08.12(21)申请号202210501884.3(51)Int.Cl.(22)申请日2020.01.08C12N9/10(2006.01)C12N15/54(2006.01)(62)分案原申请数据C12N15/82(2006.01)202010021140.22020.01.08C12N15/66(2006.01)(71)申请人江苏省农业科学院A01H5/00(2018.01)地址210014江苏省南京市玄武区钟灵街A01H6/46(2018.01)50号申请人中国科学院遗传与发育生物学研究所(72)发明人杨杰高彩霞许扬王芳权张瑞陈智慧(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204专利代理师王艳权利要求书2页说明书17页序列表11页附图6页(54)发明名称基于基因编辑技术的Wx突变型蛋白及其基因在植物育种中的应用(57)摘要本发明公开了水稻Wx突变型蛋白、突变型基因及其应用，本发明还公开利用基因编辑创制外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的育种方法。本发明首次利用基因编辑技术，对Wx基因进行单碱基编辑，通过后代的筛选，在T2代就可以获得剔除T‑DNA的、外观透明、直链淀粉含量适当降低且品质得到改良、能稳定遗传的新材料。相对于化学诱变、杂交转育等育种，基因编辑定向改良分子育种技术具有快速、精准、高效等优点，结合基因功能标记基因型选择，或者直接利用其他成熟水稻品种为背景材料进行转化并获得相应材料，将会极大提高育种效率，大大加快育种进程。CN114891759ACN114891759A权利要求书1/2页1.水稻Wx突变型蛋白，其特征在于，所述Wx突变型蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于水稻Wx的氨基酸序列的第178位氨基酸发生突变，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。2.根据权利要求1所述的水稻Wx突变型蛋白，其特征在于，所述Wx突变型蛋白的氨基酸序列还存在以下突变：其对应于水稻Wx的氨基酸序列的第159位氨基酸由甘氨酸突变为赖氨酸。3.核酸或基因，其编码权利要求1~2任一项所述的突变型蛋白。4.根据权利要求3所述的核酸或基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。5.一种用于鉴定权利要求3或4所述的基因或核酸的引物对，其特征在于，所述引物对为Wx9和/或Wx10，所述引物对Wx9序列如SEQIDNO:20和SEQIDNO:28所示，所述引物对Wx10序列如SEQIDNO:20和SEQIDNO:29所示。6.表达盒或重组载体，其含有权利要求3或4所述的核酸或基因。7.权利要求1或2所述的水稻Wx突变型蛋白、权利要求3或4所述的核酸或基因、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的表达盒或重组载体在获得外观透明、直链淀粉含量降低的水稻植物品质改良、外观透明、直链淀粉含量降低的水稻品系/品种鉴定、外观透明、直链淀粉含量降低的水稻品系品种创制和/或选育方面的应用。8.获得外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）使植物包含权利要求3或4所述的核酸或基因；或2）使植物表达权利要求1或2所述的水稻Wx突变型蛋白；所述植物为水稻。9.一种利用基因编辑创制外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：1）Wx基因的克隆及基因编辑的靶位点设计；2）含有目的片段的单碱基编辑载体的构建；3）具备权利要求1或2所述的突变型蛋白、权利要求3或4所述的核酸或基因的外观透明、直链淀粉含量适当降低的品质改良水稻的T0代植株获得；4）将目标基因突变的T0代转基因植株自交获得的T1代植株的T‑DNA片段剔除；5）T‑DNA得到剔除的T1代植株基因型再鉴定并获得目标基因纯合突变植株。10.根据权利要求9所述的育种方法，其特征在于，当水稻Wx的氨基酸序列的第178位氨基酸发生突变时，所述步骤1）的基因编辑的靶位点核苷酸序列如SEQIDNO:8所示；当水稻Wx的氨基酸序列的第178位氨基酸和159氨基酸同时发生突变时，所述步骤1）的基因编辑的靶位点核苷酸序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。11.根据权利要求9所述的育种方法，其特征在于，所述步骤2）的含有目的片段的单碱基编辑载体的构建方法如下：A）靶点接头片段制备：接头引物用ddH2O溶解成母液，互补配对的接头引物混合稀释后进行高温变性，移至室温冷却完成退火，即获得靶点接头片段；B）靶点接头片段连接中间载体：采用pHUE411中间载体、限制性内切酶BsaI进行酶切获得BsaI单酶切的pHUE411载体；采用BsaI单酶切的pHUE411载体、靶点接头片段、T4连接酶进行连接反应并进行大肠杆菌