基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115786297A(43)申请公布日2023.03.14(21)申请号202211207692.8C12N15/82(2006.01)(22)申请日2022.09.30A01H5/00(2018.01)A01H6/54(2018.01)(71)申请人河南省农业科学院地址450002河南省郑州市金水区花园路116号申请人神农种业实验室(72)发明人张新友石磊黄冰艳齐飞艳张忠信代小冬秦利刘华韩锁义孙子淇董文召(74)专利代理机构郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙)41122专利代理师张爱军(51)Int.Cl.C12N9/10(2006.01)C12N15/54(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用(57)摘要本发明涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，通过分别对花生Ah10ALS2基因序列第574位和Ah20ALS2基因序列第562位进行基因编辑，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574‑575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562‑563位发生CC→TT突变。导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸或/和Ah10ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Ser、Pro197Phe或Pro197Asn，获得纯合编辑突变植株，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。CN115786297ACN115786297A权利要求书1/2页1.一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，其特征在于，所述AhALS2突变型蛋白包括Ah10ALS2突变蛋白或/和Ah20ALS2突变蛋白；Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：6～8；Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：9～10。2.一种编码权利要求1所述AhALS2突变型蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，SEQIDNO：6～8所示的Ah10ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～3所示；SEQIDNO：9～10所示的Ah20ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4～5所示。4.如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因在花生育种中的应用。5.利用如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因建立抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)sgRNA靶点的确定：sgRNA靶点覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的第562位碱基，靶点序列3′端为PAM序列，所述靶点序列为5’‑CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG‑3’；(2)制备oligo二聚体：设计oligo序列引物Target‑Sense和Target‑Antisense，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降温速度缓慢降至20℃，在此温度下保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备；(3)CRISPR‑Cas9重组载体的构建：选用pCSGAP01载体，加入bsal内切酶1μL，bsal内切酶的buffer缓冲液5μL，加水补齐至50μL，37℃酶切1h；回收酶切后的线性化载体2μL及infusionEnzymeMix1μL，加入合成的oligo二聚体1μL，在25℃反应1h；将连接后的载体转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆载体进行质粒测序，保存测序正确的阳性菌斑，得到CRISPR‑Cas9重组载体质粒；(4)花生的遗传转化：以花生种子的胚芽为外植体，通过诱导获得胚性愈伤，用基因枪轰击法进行花生的遗传转化，经过潮霉素抗性筛选，获得再生抗性愈伤，经过成苗诱导，获得再生花生幼苗。(5)突变植株鉴定：鉴定再生花生幼苗植株是否发生预期位点的突变，保留突变株系，丢弃非突变株系；(6)抗苯磺隆类除草剂的花生新种质的获得：选择纯合突变或双等位突变的编辑植株进行繁殖，收获下一代种子，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物Target‑Sense和Target‑Antisense的序列为：Target‑Sense：5'‑TGTG