一种精液RNA的提取方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114891784A(43)申请公布日2022.08.12(21)申请号202210823067.X(22)申请日2022.07.14(71)申请人北京市农林科学院地址100097北京市海淀区曙光花园中路9号(72)发明人许晓玲刘彦白佳桦贾春云孙立晨秦玉圣肖霖力(74)专利代理机构北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙)11498专利代理师王加岭杨静(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图1页(54)发明名称一种精液RNA的提取方法(57)摘要本发明提供了一种精液RNA提取方法，该方法将精液预处理后得到的精子沉淀在PBS中重悬，用RNAstore处理过夜，离心得到精子沉淀，向精子沉淀中加入RL裂解液，60℃水浴直至溶液透亮，再用TRIzol试剂处理后离心取上清，通过离心柱法回收RNA。本发明方法法提取的RNA浓度显著高于常规RNA提取方法，且RNA的完整性和纯净度高。本发明方法具有良好的应用前景。CN114891784ACN114891784A权利要求书1/1页1.一种精液RNA的提取方法，其包括如下步骤：1）将精液加入RNase‑Free离心管，离心获得精子沉淀，将精子沉淀在PBS中重悬，用RNAstore4℃处理过夜，加入2倍体积预冷的PBS，4℃5000×g离心5min，弃上清，精子沉淀置于冰上备用；2）向精子沉淀中加入RL裂解液，60℃水浴3min直至溶液透亮，向离心管中加入与RL裂解液等体积的TRIzol试剂，涡旋15s，静置3min，4℃15000×g离心15min，取上清；3）回收RNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）回收RNA的方法是：将步骤2）得到的上清液加入等体积无水乙醇，轻柔混匀，转入RNase‑Free吸附柱CR3中吸附，离心去废液，将RNase‑Free吸附柱CR3转入收集管中，向RNase‑Free吸附柱CR3中加入去蛋白液，离心去废液，向RNase‑Free吸附柱CR3中加入漂洗液，室温静置2min，离心去废液，重复漂洗一次，静置晾干，将RNase‑Free吸附柱CR3转入新的RNase‑Free离心管中，加入RNase‑FreeddH2O室温放置2min，离心得到RNA溶液。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）裂解液的使用量为500μL。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3）回收RNA的方法是：取步骤2）得到的上清液500μL加入等体积无水乙醇，轻柔混匀，转入RNase‑Free吸附柱CR3中吸附，13,400×g离心30‑60S去废液，将RNase‑Free吸附柱CR3转入收集管中，向RNase‑Free吸附柱CR3中加入700μL去蛋白液，13,400×g离心30‑60S去废液，向RNase‑Free吸附柱CR3中加入漂洗液，室温静置2min，13,400×g离心30‑60S去废液，重复漂洗一次，静置晾干，将RNase‑Free吸附柱CR3转入新的RNase‑Free离心管中，加入RNase‑FreeddH2O室温放置2min，13,400×g离心2min得到RNA溶液。5.如权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述的精液为牛精液。2CN114891784A说明书1/6页一种精液RNA的提取方法技术领域[0001]本发明涉及核酸提取领域，具体涉及精液RNA的提取方法。背景技术[0002]精子是精原干细胞经有丝分裂、减数分裂、变形等过程形成的一种以染色质浓缩、细胞器外排为特点的高度分化的单倍体细胞。研究发现，哺乳动物精子RNA含量极少，提取完整RNA的难度较大。此外，奶牛精子细胞膜表面存在大量二硫键来维持膜结构稳定，普通试剂无法打断二硫键，导致牛精子RNA、蛋白质提取困难。[0003]目前常见的RNA提取方式包括采用TRIzol法以及采用离心柱法进行提取。TRIzol法典型的是Invitrogen的TRIzol商业试剂盒，离心柱法典型的是Tiangen的RNA/DNA/蛋白质提取试剂盒。发明人采用这两中典型的商业试剂盒按照说明书进行牛精子RNA的提取时，发现提取效率并不高。[0004]Chen等人向TRIzol中添加5%β巯基乙醇，60℃水浴30min，可以完全裂解牛精子，获得较高浓度RNA。但其获得的RNA量仍然有很大提升空间。发明内容[0005]本发明的目的在于针对现有技术中精液RNA提取中的不足，提供一种精液RAN提取方法。[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种精液RNA的提取方法，其包括如下步骤：1）将精液加入RNase‑Free离心管，离心获得精子沉淀，将精子沉淀在PBS中重悬，用RNAstore4