一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115010184A(43)申请公布日2022.09.06(21)申请号202210408881.5G01N33/569(2006.01)(22)申请日2022.04.19G01N33/551(2006.01)G01N33/531(2006.01)(71)申请人北京农学院C12Q1/6804(2018.01)地址102206北京市昌平区回龙观镇北农C12Q1/689(2018.01)路7号C12R1/445(2006.01)(72)发明人王真程如楠李磊甄思慧刘洪蕾武周慧王瑜(74)专利代理机构焦作加贝专利代理事务所(普通合伙)41182专利代理师冯新志(51)Int.Cl.C01G49/08(2006.01)B01J13/06(2006.01)H01F1/42(2006.01)H01F41/00(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表3页附图5页(54)发明名称一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增检测方法(57)摘要本发明提供了一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增检测方法，首先利用溶剂热法制备超顺磁性羧基化四氧化三铁磁珠，然后将热灭活的金黄色葡萄球菌作为免疫原获得了兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体，借助碳二亚胺法将二者相连，对偶联条件及磁珠抗体质量比进行优化以获得高性能免疫磁珠；其次，筛选重组酶聚合酶扩增技术最佳引物，检测其灵敏度、特异性，最终对免疫磁珠‑重组酶聚合酶扩增检测方法在人工污染样品及临床样品的应用效果进行评估。经充分验证，该检测方法具有高灵敏度、高特异性、简便快速的特点，是一种非常有效的畜产品中金黄色葡萄球菌的实时监测技术。CN115010184ACN115010184A权利要求书1/1页1.一种羧基化四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于：其包括：将六水三氯化铁和醋酸钠分别溶解在乙二醇中搅拌至溶解后混合，将混合液倒入反应釜中进行升温反应，待反应结束后降至室温，清洗，真空干燥，获得羧基化四氧化三铁磁珠。2.根据权利要求1所述的羧基化四氧化三铁磁珠的制备方法，其特征在于：所述六水三氯化铁的摩尔浓度0.1‑0.15mol/L，醋酸钠的摩尔浓度0.5‑1mol/L；和/或，所述搅拌的转速为250‑500rpm，时间为3‑6h；和/或，所述升温反应的温度为160‑220℃，反应的时间为4‑8h；和/或，所述真空干燥的温度为50‑70℃，时间为6‑9h。3.一种羧基化四氧化三铁磁珠，其特征在于：其由权利要求1或2所述的制备方法得到。4.一种利用权利要求3所述的羧基化四氧化三铁磁珠来制备金黄色葡萄球菌免疫磁珠的方法，其特征在于：其包括如下步骤：（1）、用预冷的2‑（N‑吗啉）乙磺酸分别溶解1‑乙基‑3‑（3‑二甲基氨丙基）‑碳化二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺，配制成1‑乙基‑3‑（3‑二甲基氨丙基）‑碳化二亚胺溶液、N‑羟基琥珀酰亚胺溶液；将羧基化四氧化三铁磁珠离心，磁分离，弃上清，清洗数次；然后先加入1‑乙基‑3‑（3‑二甲基氨丙基）‑碳化二亚胺溶液混匀，再向溶液中加入N‑羟基琥珀酰亚胺溶液混匀，活化；（2）、使用2‑（N‑吗啉）乙磺酸溶液清洗步骤（1）中处理过的磁珠，然后加入2‑（N‑吗啉）乙磺酸溶液和兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体，置于温箱孵育，磁分离，弃上清；（3）、加入含牛血清白蛋白的磷酸缓冲液，置于混匀仪上封闭；（4）、用含叠氮化钠和牛血清白蛋白的溶液，磷酸缓冲液作为免疫磁珠保存液重悬免疫磁珠，保存备用。5.根据权利要求4所述的制备金黄色葡萄球菌免疫磁珠的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述活化的温度为25‑37℃，时间为0.5‑1h；和/或，步骤（2）中，所述温箱的温度为37℃，时间为0.5‑1.5h；和/或，步骤（3）中，所述封闭的温度为37℃，时间为0.5‑1.5h。6.一种金黄色葡萄球菌免疫磁珠，其特征在于：其由权利要求4所述的方法得到。7.一种金黄色葡萄球菌免疫磁珠‑重组酶聚合酶扩增的检测方法，其特征在于：其包括：结合重组酶聚合酶扩增技术，利用设计的引物对使用金黄色葡萄球菌免疫磁珠分离出的金黄色葡萄球菌进行扩增与检测；所述金黄色葡萄球菌免疫磁珠为权利要求6所述的金黄色葡萄球菌免疫磁珠。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述引物的序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16所示。2CN115010184A说明书1/8页一种基