一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115104535A(43)申请公布日2022.09.27(21)申请号202210858824.7(22)申请日2022.07.20(71)申请人浙江农林大学地址311300浙江省杭州市临安区武肃街666号(72)发明人崔永一卢俊罗平毛奎静(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200专利代理师邱启旺(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图9页(54)发明名称一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法(57)摘要本发明公开了一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，选择蝴蝶兰花梗为初代培养材料，以初代培养获得的无菌苗叶片为材料，经过23～30天培养可诱导出类原球茎，将类原球茎接种至增殖培养基中可持续增殖扩繁，转入分化培养基后进行分化培养30～45天，将分化出的无根系小苗接入生根培养基中进行生根培养,经30～45天得到再生植株。在蝴蝶兰各阶段培养过程中，对培养基组分如基本培养基、植物生长调节剂、防褐化物质等进行调整，获得了一套高效稳定的蝴蝶兰再生体系。本发明获得的类原球茎可作为农杆菌介导的蝴蝶兰遗传转化的受体材料，为蝴蝶兰转基因新品种创制奠定基础。CN115104535ACN115104535A权利要求书1/2页1.一种以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)蝴蝶兰无菌苗获得：将蝴蝶兰的带腋芽花梗段经一系列消毒灭菌操作后切成带芽茎段，接种于初代培养基上进行培养，得到蝴蝶兰的无菌苗，然后在无菌苗增殖培养基上进行培养获得更多无菌苗；2)类原球茎诱导：选取生长30‑45d的无菌苗幼嫩叶片，将其切割成块，接种于类原球茎诱导培养基中，在黑暗条件下培养7‑10d后转入正常光照条件下继续培养，在叶片伤口部位诱导出类原球茎；3)类原球茎防褐化及其增殖培养：诱导出的蝴蝶兰类原球茎接种于类原球茎防褐化及增殖培养基，在正常光照条件下，进行类原球茎的增殖培养；4)类原球茎分化培养：将类原球茎接种于类原球茎分化培养基，在正常光照条件下进行培养，使其分化出无根小苗；5)生根成苗培养：将分化出的无根小苗接种于生根培养基中，在正常光照条件下进行培养，使其再生为完整植株。2.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，步骤3)中，类原球茎增殖培养阶段，光照强度为2100‑2300lx；所述类原球茎防褐化及增殖培养基包括浓度为5mg/L的6‑BA。优选地，所述类原球茎防褐化及增殖培养基：以1/2MS为基本培养基，附加6‑BA5mg/L，AD3mg/L，AC1g/L，蔗糖15g/L，植物凝胶3g/L，玉米粉10g/L，CM15％，蛋白胨1.5g/L，加入蒸馏水至1L，pH5.5‑5.8。3.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，步骤3)中，步骤2)得到的类原球茎接种到类原球茎防褐化及增殖培养基上，在活性炭AC1g/L+玉米粉10g/L条件下增殖培养。4.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，步骤4)中，类原球茎分化培养基中的基本培养基为花宝1号1g/L+花宝2号1g/L，植物生长调节剂为6‑BA2mg/L+IBA0.5mg/L。5.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，所述正常光照条件：光照强度为2100‑2300lx、光照时间为14h/d、温度为25±2℃。6.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，所述初代培养基：以1/2MS为基本培养基，附加6‑BA5mg/L，KT2mg/L，NAA1.5mg/L，植物凝胶3g/L，蛋白胨1.5g/L，蔗糖20g/L，CM20％，加入蒸馏水至1L，pH调至5.5‑5.8。7.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，所述无菌苗增殖培养基：以花宝1号1g/L+花宝2号1g/L为基本培养基，附加6‑BA3mg/L，TDZ0.5mg/L，植物凝胶3g/L，玉米粉10g/L，蔗糖20g/L，CM15％，加入蒸馏水至1L，pH5.5‑5.8。8.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，所述类原球茎诱导培养基：以1/2MS为基本培养基，附加6‑BA4mg/L，TDZ0.7mg/L，蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，蛋白胨1‑1.5g/L，CM15％，加入蒸馏水至1L，pH5.5‑5.8。9.根据权利要求1所述以叶片为外植体的蝴蝶兰再生为完整植株的方法，其特征在于，所述类原球茎分化培养基：以花宝1号1g/L+花宝2号1g/L为基本培养基，附加6‑