一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6-羟基石斛次碱的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115144491A(43)申请公布日2022.10.04(21)申请号202210706723.8(22)申请日2022.06.21(71)申请人安徽农业大学地址230036安徽省合肥市蜀山区长江西路130号(72)发明人杜先锋高雨晨林丽夏姚姚(74)专利代理机构合肥和瑞知识产权代理事务所(普通合伙)34118专利代理师王挺(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/72(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6-羟基石斛次碱的方法(57)摘要本发明涉及一种高效提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法。该方法以GC‑MS法检测霍山石斛中的6‑羟基石斛次碱，先自霍山石斛鲜茎中提取含6‑羟基石斛次碱的待测液用于检测，提取方法为：将霍山石斛鲜茎冻干粉碎过筛得到石斛干粉，加水超声处理后，加入复合酶酶解，得到酶解液；酶解液中加入酸性醇，超高压下提取1min后，取滤液；滤液真空浓缩后，使用MCX萃取柱纯化，甲醇‑乙腈溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至无水分后，再用甲醇溶解过滤，得到待测液。本发明为霍山石斛中的特征生物碱6‑羟基石斛次碱的提取纯化和分离鉴定提供了一套高效且完整的方法，对6‑羟基石斛次碱的提取具有重要意义。CN115144491ACN115144491A权利要求书1/1页1.一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法，其特征在于，所述6‑羟基石斛次碱采用GC‑MS法检测，自霍山石斛鲜茎中提取含6‑羟基石斛次碱的待测液用于检测，提取方法包括以下步骤：S1.将霍山石斛鲜茎通过冻干法脱水，粉碎过筛得到石斛干粉，备用；S2.取S1中石斛干粉加入水中，超声处理20～30min后，加入占石斛干粉质量1.5％的复合酶，酶解1.5h，得到酶解液，所述石斛干粉和水的使用比为1g:6mL；S3.在酶解液中加入设定量的酸性醇，室温放置18～24h后，在真空且超高压100MPa环境下处理1min，过滤残渣，取滤液；S4.将所述滤液真空浓缩至5～8mL后，使用MCX萃取柱纯化，甲醇‑乙腈溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至无水分后，再用甲醇溶解过滤，得到含有6‑羟基石斛次碱的待测液。2.如权利要求1所述的一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法，其特征在于，所述步骤S1中，冻干的温度为‑50℃，冻干时间40～48h，粉碎细度为80目。3.如权利要求1所述的一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法，其特征在于，所述步骤S2中，复合酶由纤维素酶和果胶酶以10000U/g等活力配制。4.如权利要求1所述的一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法，其特征在于，所述步骤S3中，以酶解液:酸性醇体积比1:40添加所述酸性醇，所述酸性醇为体积浓度70％的乙醇水溶液，pH值为3～3.5。5.如权利要求1所述的一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法，其特征在于，所述步骤S4中，MCX萃取柱纯化的具体操作为：浓缩后的滤液使用质量浓度2～5％H3PO4水溶液溶解，过0.22μm水系滤膜，得到上样液体；MCX萃取柱依次使用5～8ml甲醇和5～8ml水活化，将上样液体按照0.5～1.0ml/min流速上样，上样结束后，使用3～5mL质量浓度2‑5％甲酸水溶液进行淋洗；淋洗后用含有占溶液体积比3～5％氨水的甲醇/乙腈溶液进行洗脱，得到洗脱液。6.如权利要求1所述的一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法，其特征在于，所述GC‑MS法检测包括气相色谱和质谱，其中气相色谱的具体操作为：色谱柱初始柱温70℃，并保持2℃/min上升，直至150℃后维持1min，再以3℃/min上升至180℃后维持1min，再以20℃/min上升至240℃后维持3min；期间，载气为高纯度He，以1.0ml/min流速进气；分流比设定为20:1；质谱的具体操作为：EI离子源；离子能量设置为70eV；温度设定为200℃；全扫描测定方式的扫描范围m/z40‑500。2CN115144491A说明书1/5页一种提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法技术领域[0001]本发明属于检测技术领域，具体涉及一种高效提纯并检测霍山石斛鲜茎中6‑羟基石斛次碱的方法。技术背景[0002]石斛中生物碱具有清热养胃、明目清音、退热、止痛作用，还可用于降低血压、心率，减慢呼吸，并可解巴比妥中毒。[0003]生物碱在植物体内的存在形式，少数碱性极弱的以游离状态存在，多数都以成盐的形式存在于植物细胞内。目前，在生物碱提取方面的研究表明：游离的生物碱溶于亲脂性有机溶剂或者醇类溶剂而不溶于水，而成盐