一种大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115136893A(43)申请公布日2022.10.04(21)申请号202210939187.6(22)申请日2022.08.05(71)申请人江苏省农业科学院地址210014江苏省南京市玄武区钟灵街50号(72)发明人刘春晓钱亚明朱海军蔡恒张涛(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所32237专利代理师徐芝强肖明芳(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书2页说明书8页附图4页(54)发明名称一种大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法(57)摘要本发明公开了一种大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，包括外植体消毒、外植体制备、不定芽的诱导、不定芽的增殖与伸长诱导、生根诱导、炼苗与移栽、初生愈伤组织诱导、再分化诱导。本发明选取大籽猕猴桃幼嫩枝条组织作为外植体材料，经过脱毒处理，无菌组织培养的组培快繁技术，成功获得大籽猕猴桃无菌脱毒快繁苗。以组培苗下胚轴和叶片成功诱导愈伤组织，减少了材料脱毒程序及季节性限制，初生愈伤更易获得，并成功诱导不定芽，愈伤组织成功率高达90％。CN115136893ACN115136893A权利要求书1/2页1.一种大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外植体消毒：选取当年生野生大籽猕猴桃健壮新生的幼嫩枝条，扦插成活后的幼苗作为外植体，清洗后去掉嫩茎上的叶片，经灭菌消毒后，晾干得到脱毒枝条；(2)外植体制备：将步骤(1)脱毒枝条截成1‑2cm带腋芽的茎段，用解剖刀将其纵剖成两半，带芽的部分向上垂直接种于初代培养基中，培养得到初生芽体；(3)不定芽的诱导：待步骤(2)初代培养获得的初生芽体，生长到2‑3cm左右，从母体上切取下来，转接到继代培养基上继续诱导，待分化成完全再生芽；(4)不定芽的增殖与伸长诱导：将步骤(3)完全再生芽解剖分离，多次继代后，转到增殖培养基上，进行扩繁，分化成苗，继续诱导不定芽伸长，新生不定叶；(5)生根诱导：待步骤(4)伸长植株株高3‑5cm左右，分离植株转移到生根培养基上继代培养，直至大量不定根生根；(6)炼苗与移栽：将步骤(5)得到的快繁生根苗，于光照下培养，随后将组培苗取出，清洗培养基，待根系发达，新生叶复壮，进行基质移栽，适量浇水后，在温室条件下培养；(7)初生愈伤组织诱导：将步骤(6)大籽猕猴桃组培苗作为外植体材料，取其下胚轴或者叶片接种于愈伤组织诱导培养基中，进行初生愈伤组织的诱导；(8)再分化诱导：将步骤(7)获得的初生愈伤组织，进行愈伤组织的再分化诱导，再分化出不定芽，最终获得完整的再生植株。2.根据权利要求1所述的大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，其特征在于，步骤(1)中，选取的外植体先用洗洁精浸泡30min，自来水冲洗1‑2h，然后去掉嫩茎上的叶片，超纯水冲洗1次，放入灭菌瓶置于超净台；用75％酒精浸泡30sec，超纯水洗一遍，然后用含有1‑2滴吐温的0.1％升汞浸泡8‑10min，最后无菌水冲洗5‑6次，晾干得到脱毒枝条。3.根据权利要求1所述的大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，其特征在于，步骤(2)中，所述初代培养基采用MS培养基的无机盐，添加2.0mg/L6‑BA与0.3mg/LNAA，30g/L蔗糖，6.0g/L琼脂，水解酪蛋白0.5g/L，活性炭0.2g/L，调节pH值为5.8‑6.0；带芽部分接种于初代培养基中初代培养20‑30d，培养温度为(26±1)℃；相对湿度为70％‑80％；光照时间为12h/d；光照强度为2000lux。4.根据权利要求1所述的大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的继代培养基采用MS培养基的无机盐，添加1.0mg/L6‑BA与0.08mg/LNAA，30g/L蔗糖，6.0g/L琼脂，水解酪蛋白0.5g/L，活性炭0.2g/L，调节pH值为5.8‑6.0；切取下来的初生芽体转接到继代培养基中继续诱导1‑2周，待分化成完全再生芽；培养温度为(26±1)℃；相对湿度为70％‑80％；光照时间为12h/d；光照强度为2000lux。2CN115136893A权利要求书2/2页5.根据权利要求1所述的大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的增殖培养基采用MS培养基的无机盐，添加1.0mg/L6‑BA、0.5mg/LZT与0.03mg/LNAA，30g/L蔗糖，6.0g/L琼脂，水解酪蛋白0.5g/L，活性炭0.2g/L，调节pH值为5.8‑6.0；转到增殖培养基扩繁2‑3周，培养温度为(26±1)℃；相对湿度为70％‑80％；光照时间为12h/d；光照强度为2000lux。6.根据权利要求1所述的大籽猕猴挑的愈伤组织再生体系建立方法，其特征在于，