一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115161337A(43)申请公布日2022.10.11(21)申请号202210927408.8C12N15/56(2006.01)(22)申请日2022.08.03(71)申请人吉林农业大学地址130000吉林省长春市新城大街2888号(72)发明人赵丹孙文献邹佳营李大勇邱姗姗南楠杨翠江春泉于思文(74)专利代理机构徐州君撷知识产权代理有限公司32673专利代理师李杰(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)权利要求书1页说明书4页附图3页(54)发明名称一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用(57)摘要本发明公开了一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，该基因编码区为1020bp，由340个氨基酸组成，用InterPro和Pfam网站对UvGHF1的结构域进行预测发现，UvGHF1包含N端信号肽(SignalPeptide)和糖苷水解酶GH42结构域。本发明通过Phyre2在线同源建模预测分析，以嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)β‑半乳糖苷酶晶体结构1KWG为模板，构建了UvGHF1蛋白同源三维结构模型。本发明通过构建异源表达稻曲病菌UvGHF1基因的转基因水稻植株，发现转基因水稻能够显著提高对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病的抗性，首次阐明了该基因具有正向调控水稻抗病性的功能。本发明提供的UvGHF1基因是一种适用于创制高抗稻曲病、稻瘟病和白叶枯病的水稻新材料的新基因资源，可以用于改良水稻抗病性，对于水稻抗病新种质的创CN115161337A制和新品种的选育具有重要意义。CN115161337A权利要求书1/1页1.一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，其特征在于，用InterPro和Pfam网站对UvGHF1的结构域进行预测，稻曲病菌UvGHF1蛋白包含N端信号肽(SignalPeptide)和糖苷水解酶GH42结构域，异源表达稻曲病菌基因UvGHF1的转基因水稻提高了对稻曲病、稻瘟病和白叶枯病的抗性。2.根据权利要求1所述的一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，其特征在于：Phyre2在线同源建模预测分析表明，UvGHF1含有糖苷水解酶GH42结构域，以嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)β‑半乳糖苷酶晶体结构1KWG为模板，构建了UvGHF1蛋白同源三维结构模型。3.根据权利要求1或2所述的一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，其特征在于：构建异源表达UvGHF1基因的转基因水稻株系，利用pTA7001植物表达载体，将全长UvGHF1克隆到载体中，通过农杆菌介导转化法，获得了地塞米松(Dexamethasone，DEX)诱导表达的UvGHF1日本晴转基因株系；潮霉素抗性作为转基因的抗性标记使用；在1/2MS培养基中加入潮霉素，可以筛选出转化子；由于FLAG与UvGHF1为融合蛋白，所以用FLAG抗体检测UvGHF1蛋白的表达情况；10μMDEX处理转基因水稻和野生型水稻16小时后，Western‑blot结果显示，UvGHF1蛋白在17SD6和17SD27转基因植株中都能表达，且在无诱导情况下或野生型中没有基础表达背景，因此获得2个异源表达UvGHF1基因的转基因T3代纯合株系(17SD6和17SD27)。4.根据权利要求3所述的一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，其特征在于：稻曲病菌在水稻抽穗前从水稻花器侵入，发病后期有大量的厚垣孢子形成，将被侵染的花丝包裹后形成稻曲球。使用10μMDEX处理转基因水稻和日本晴野生型，处理16小时后，通过人工注射接种稻曲病菌悬浮液，接种后28天拍照观察发现，DEX处理后的转基因水稻中的稻曲球数量显著低于日本晴野生型，结果表明，异源表达UvGHF1的转基因水稻提高了对稻曲病抗性。5.根据权利要求4所述的一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，其特征在于：使用10μMDEX处理转基因水稻和日本晴野生型，处理16小时后，通过喷雾接种法接种稻瘟病菌孢子悬浮液，接种7天后，拍照并提取发病叶片中水稻与稻瘟菌DNA，通过分子检测与分析真菌生物量发现，DEX处理后的转基因水稻中的稻瘟菌生物量显著低于日本晴野生型，结果表明，异源表达UvGHF1的转基因水稻的提高了对稻瘟病的抗性。6.根据权利要求4或5所述的一种稻曲病菌基因UvGHF1及其在水稻抗病中的应用，其特征在于：使用10μMDEX处理转基因水稻和日本晴野生型，处理16小时后，通过剪叶法接种白叶枯菌悬浮液，接种14天后，拍照并测量病斑长度，结果显示，DEX处理后的转基因水稻