稻瘟病菌VAD1基因及其在创制抗病水稻中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927410A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211141070.X(22)申请日2022.09.20(71)申请人浙江省农业科学院地址310021浙江省杭州市上城区德胜中路298号(72)发明人王教瑜邱海萍张震柴荣耀郝中娜毛雪琴王艳丽孙国昌(74)专利代理机构杭州中成专利事务所有限公司33212专利代理师金祺(51)Int.Cl.C12N15/55(2006.01)C12N15/84(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)权利要求书1页说明书18页序列表（电子公布）附图9页(54)发明名称稻瘟病菌VAD1基因及其在创制抗病水稻中的应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用HIGS技术进行水稻抗稻瘟病的应用，即涉及以稻瘟病菌致死基因VAD1为靶点的抗稻瘟病转基因水稻创制。本发明公开了一种VAD1基因的用途：提高水稻抗稻瘟病能力；所述VAD1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明能实现培育可持久抗稻瘟病的转基因水稻品种。CN115927410ACN115927410A权利要求书1/1页1.VAD1基因的用途，其特征在于：提高水稻抗稻瘟病能力；所述VAD1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的VAD1基因的用途，其特征在于：培育可持久抗稻瘟病的转基因水稻品种。3.根据权利要求1或2所述的VAD1基因的用途，其特征在于：构建了2个具有相反方向的HIGS载体pCV‑VAD1234和pCV‑VAD5678，转化水稻CO39，从而获得转基因水稻VAD1234、VAD5678。4.以稻瘟病菌致死基因VAD1为靶点的抗稻瘟病转基因水稻的构建法，其特征在于：包括用为SEQIDNo：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。5.根据权利要求4所述的以稻瘟病菌致死基因VAD1为靶点的抗稻瘟病转基因水稻的构建法，其特征在于：转基因阳性株表现出稻瘟病抗性。6.根据权利要求4所述的以稻瘟病菌致死基因VAD1为靶点的抗稻瘟病转基因水稻的构建法，其特征在于：转基因水稻中干扰片段的表达显著抑制了病原菌靶基因表达，进而抑制了病菌在叶片细胞内的扩展，从而降低了发病程度。2CN115927410A说明书1/18页稻瘟病菌VAD1基因及其在创制抗病水稻中的应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用HIGS技术进行水稻抗稻瘟病的应用，即涉及以稻瘟病菌致死基因VAD1为靶点的抗稻瘟病转基因水稻创制。背景技术[0002]稻瘟病是发生在水稻上最具破坏力的病害之一，由子囊菌Magnaportheoryzae侵染引起，在全世界水稻种植区几乎都有发生(Qinetal.,2021；Yangetal.,2021)。除了水稻，稻瘟病菌还能侵染小麦、大麦、稷等多种禾本科作物和杂草(Talbotetal.,2003)。利用抗性基因培育抗病品种是目前稻瘟病防控的最主要途径。然而，由于抗性基因的高度特异性和病菌群体的高频变异性，抗性基因介导的抗性容易被病菌逃避。因此，迫切需要发掘新的广谱的抗病方法防治稻瘟病。鉴定稻瘟病菌生长发育和侵染过程中的关键基因，明确它们的功能，进而选择其中的基因作为靶点，通过现代生物学的手段(如寄主诱导的基因沉默技术，HIGS)进行抑制，从而抑制病菌生长，有望实现稻瘟病的持续有效控制。[0003]至目前，多个参与稻瘟病菌侵染过程的基因通过基因敲除的策略得到鉴定，涉及病菌侵染各个过程(Talbotetal,1993；Thinesetal,2000；Wangetal,2019)。这些结果使稻瘟病菌成为植物病原真菌致病机理研究的理想模式生物。然而，利用基因敲除研究基因功能的策略，存在天生的弊端，就是无法对影响基础生命代谢的基因进行研究，因为这些基因的敲除往往会导致病原菌死亡而无法得到突变体。因此，稻瘟病菌中此类基因的功能报道极少。而另一方面，此类基因却往往可能是控制病菌的理想靶点。[0004]RNA干扰技术(RNAi)通过识别mRNA，在转录水平上对基因进行部分抑制，而并不完全去除基因，因此能够弥补基因敲除技术的缺陷，对影响生物体存活而无法敲除的基因进行研究。宿主诱导基因沉默(HIGS)在RNAi基础上发展而来，通过在植物体内表达病原真菌基因的RNAi结构，沉默目的基因，从而实现病害控制并能验证这些基因在致病过程中的作用(Nunes和Dean，2012)。近年来，HIGS技术已在多种病原真菌进行了尝试，包括禾谷镰刀菌、禾谷青霉、小麦条锈菌、小麦条锈菌、尖孢镰刀菌和灰葡萄孢菌等。近年来，稻瘟病菌中的HIGS有少量相关报道。Wang等人(2015)利