新城疫疫苗株及其构建方法、禽类免疫识别方法、应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115161294A(43)申请公布日2022.10.11(21)申请号202210653186.5(74)专利代理机构广州市科丰知识产权代理事(22)申请日2022.06.09务所(普通合伙)44467专利代理师罗啸秋(83)生物保藏信息CCTCCNO:V2022352022.05.07(51)Int.Cl.C12N7/01(2006.01)(71)申请人广东省农业科学院动物卫生研究所C12N15/85(2006.01)地址510640广东省广州市天河区五山白G01N33/68(2006.01)石岗街动物卫生研究所A61K39/17(2006.01)申请人浙江迪福润丝生物科技有限公司A61P31/14(2006.01)华南农业大学C12R1/93(2006.01)广东永顺生物制药股份有限公司(72)发明人孙敏华宋家升周洁任涛廖明孙慧敏董嘉文韩翡涂玉蓉李林林张俊勤黄允真权利要求书1页说明书10页序列表34页附图2页(54)发明名称新城疫疫苗株及其构建方法、禽类免疫识别方法、应用(57)摘要本发明属于生物技术领域，公开了一种新城疫疫苗株，分类名为新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)，保藏编号为：CCTCCNo：V202235；保藏日期：2022年5月7日，保藏单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心。该疫苗株突变缺失了HN蛋白的关键中和位点，通过病毒拯救获得了重组病毒rLa‑mGM。将重组病毒和LaSota疫苗免疫SPF鸡后，通过测定HI抗体能够确定是否免疫成功，通过间接ELISA方法能够实现野毒和疫苗毒的鉴别。同时，本发明还提供了该疫苗株的构建方法、禽类免疫识别方法、应用。CN115161294ACN115161294A权利要求书1/1页1.一种新城疫疫苗株，其特征在于，分类名为新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)，保藏编号为：CCTCCNo：V202235；保藏日期：2022年5月7日，保藏单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心。2.一种禽类免疫识别方法，其特征在于，将禽类血清与测试蛋白反应，根据反应结果，判断检测对象体内是否具有针对于如权利要求1所述疫苗株的抗体；所述测试蛋白为494DEQARLNPVSAVFDNI509‑BSA藕连蛋白。3.一种如权利要求1所述的疫苗株的构建方法，其特征在于，用VII型毒株GM株的F和HN基因替换掉LaSota疫苗株的F和HN基因，得到疫苗株。4.根据权利要求3所述的疫苗株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：以含VII型毒株GM株F和HN基因的质粒为模板，利用引物GM‑F‑F和引物GM‑ZR‑R扩增获得F蛋白裂解位点突的片段1；利用引物GM‑ZR‑F和引物GM‑HN‑R扩增获得F蛋白裂解位点突的片段2；步骤2：以pBeloBAC11‑LaSota全长cDNA克隆质粒为模板，利用引物ZT‑L+GM‑F和引物ZT‑L‑R扩增获得骨架基因片段3；步骤3：将片段1、片段2、片段3同源重组得到以LaSota株为骨架，嵌合GM株F基因突变和HN基因的重组cDNA克隆；步骤4：利用引物HN2‑F和引物L+GM‑R15186扩增重组cDNA克隆获得HN基因突变的片段4，利用引物L+GM‑F15158和引物HN2‑R扩增重组cDNA克隆获得骨架片段5，利用同源重组试剂盒连接片段4和5，提取全长cDNA质粒，将突变后构建质粒的命名为pBeloBAC11‑La‑mGM；步骤5：将全长质粒pBeloBAC11‑La‑mGM和辅助质粒对细胞转染并接种鸡胚，得到疫苗株；所述引物GM‑F‑F、引物GM‑ZR‑R、引物GM‑ZR‑F、引物GM‑HN‑R、引物ZT‑L+GM‑F、引物ZT‑L‑R、引物HN2‑F、引物L+GM‑R15186、引物L+GM‑F15158、引物HN2‑R的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：10所示。5.根据权利要求4所述的疫苗株的构建方法，其特征在于，所述步骤5具体为：以4：2：1：1的比例依次加入全长质粒pBeloBAC11‑La‑mGM和辅助质粒pCI‑NP、pCI‑P、pCI‑L，利用LTX试剂转染BSR‑T7/5细胞，转染24h后，加入终浓度为1μg/μL的TPCK胰酶继续培养，转染60h后，冻融1次，将细胞混合物接种至9日龄SPF鸡胚尿囊腔，培养72h对尿囊液进行血凝活性检测，有HA效价的尿囊液即为拯救成功的重组病毒即疫苗株。6.如权利要求1所述的疫苗株在新城疫疫苗制备中的应用。7.含如权利要求1所述的疫苗株的生物制品。2CN115161294A说明书1/10页新城疫疫苗株及其构建方法、禽类免疫识别方法、应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体为一种新城