一株鼠伤寒沙门氏菌htpG及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115197888A(43)申请公布日2022.10.18(21)申请号202210326623.2(51)Int.Cl.(22)申请日2022.03.30C12N1/21(2006.01)C12N15/74(2006.01)(66)本国优先权数据C12Q1/02(2006.01)202111158090.32021.09.28CNC12R1/42(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20219572021.07.30(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山街五山路483号(72)发明人左建军董涛冯定远王伟唯叶慧曹庆云张常明(74)专利代理机构东莞市卓易专利代理事务所(普通合伙)44777专利代理师张晓华权利要求书2页说明书14页附图11页(54)发明名称一株鼠伤寒沙门氏菌htpG及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一株鼠伤寒沙门氏菌htpG及其构建方法和应用，所述鼠伤寒沙门氏菌htpG保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2021957，保藏日期为2021年7月30日。其基于Red同源重组技术对鼠伤寒沙门氏菌进行改造，且为鼠伤寒沙门氏菌的防治提供理论基础。CN115197888ACN115197888A权利要求书1/2页1.一株鼠伤寒沙门氏菌htpG(SalmonellatyphimuriumhtpG)，其特征在于，所述鼠伤寒沙门氏菌htpG保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2021957，保藏日期为2021年7月30日。2.一种权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌htpG的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：外源靶基因片段扩增，其扩增引物对组包括htpG基因两侧的延伸同源序列以及pKD4质粒互补序列；制备鼠伤寒沙门氏菌野生菌感受态细胞，并在其中转入pKD46质粒，制备得到含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌；鼠伤寒沙门氏菌htpG基因敲除，以得到鼠伤寒沙门氏菌htpG缺失菌株。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，外源靶基因片段扩增时，扩增引物对组中的上游引物F1序列为：ATGGCATTGTTGAGGTCTATCCACATGAAAGGACAAGAAACGCGTGGTTTTCAGTCAGAAGCGATTGTGTAGGCTGGAG，下游引物R1序列为：TCAGGACACCAGCAACTGGTTCATACGGCGGATAAACTGGTTCGGATCTTCCAGCGTACCAACGGCTGACATGGGAATT。4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，鼠伤寒沙门氏菌htpG基因敲除包括如下步骤：制备含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞；将外源靶基因片段转至含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞中，获得重组鼠伤寒沙门氏菌；将pCP20质粒转导入重组鼠伤寒沙门氏菌中，诱导其表达可识别FRT位点的FLP重组酶，以将两个FRT位点间的靶基因片段消除，以得到鼠伤寒沙门氏菌htpG。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，制备含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞包括如下步骤：(1)挑取含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌单菌落接种于2mL的LB培养基中，获得菌液，并于30℃，180r/min条件下过夜培养；(2)过夜培养后，取1mL新鲜菌液接种于50mLLA培养基中，并于30℃，220r/min条件下培养，待OD600＝0.2～0.3时加入L‑阿拉伯糖，以诱导重组酶进行表达，直至菌液终浓度为30mM；(3)当OD600＝0.5～0.6时，取20mL菌液至预冷的50mL无菌离心管中冰浴30min，期间缓慢摇晃菌液数次，保证菌液冷却充分；(4)取充分冷却后的菌液，于5000r/min，4℃条件下离心15min，弃上清，收集细菌沉淀，并用体积分数10％的无菌甘油洗涤细菌沉淀两次；(5)取1mL体积分数10％的10％无菌甘油对洗涤后的细菌沉淀进行重悬，然后将重悬后的菌液分装于1.5mL无菌离心管中，并保存于‑80℃超低温冰箱中。6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将外源靶基因片段转至含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞中，获得重组鼠伤寒沙门氏菌包括如下步骤：(1)取含有pKD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞菌液中与外源靶基因片段混匀，冰上放置3～5min，以获得混合体系，且预冷电转杯；(2)设置电转仪参数；(3)将所述混合体系加入到电转杯底部，擦干电转杯外部的冷凝水，将电转杯放入电转2CN115197888A权利要求书2/2页仪中进行脉冲电击；(4)脉冲结束后，在所述混合体系中加入1mL的SOC培养基进行轻柔吹打，然后将所述混合体系转移至2mL无菌离心