一种复合菌群混合发酵方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115232762A(43)申请公布日2022.10.25(21)申请号202210634623.9(22)申请日2022.06.07(71)申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号(72)发明人荀卫兵张瑞福王文瑜任轶沈其荣(74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218专利代理师傅婷婷徐冬涛(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12R1/01(2006.01)C12R1/38(2006.01)C12R1/07(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图13页(54)发明名称一种复合菌群混合发酵方法(57)摘要本发明公开了一种复合菌群混合发酵方法。所述的混合发酵技术基于不同菌株的代谢底物竞争强度、最佳培养条件、生长速度、代谢产物对菌株共存的影响等特征，建立了“分批接种‑条件控制‑按需补料”的合成菌株混合发酵体系。该发酵技术具备资源消耗低、发酵产物菌种组成均一度高的特点，与常规混菌发酵方式相比，在摇瓶体系中发酵24小时能提高总菌体数量约1.5个数量级，发酵罐扩大培养能在摇瓶体系基础上再提高0.37个数量级。CN115232762ACN115232762A权利要求书1/2页1.一种复合菌群的混合发酵方法，所述的复合菌群由8株根际益生细菌组成，分别为鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)RFAci‑1、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)RFPse‑1、日本假黄单胞菌(Pseudoxanthomonasjaponensis)RFPth‑1、洋葱伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)RFBur‑1、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)RFSte‑1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)RFBac‑1、土壤溶杆菌(Lysobactersoli)RFLys‑1和路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)RFEnt‑1；上述八株菌株皆保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期均为2020年12月07日，鲍曼不动杆菌RFAci‑1保藏编号为CGMCCNo.21321、施氏假单胞菌RFPse‑1保藏编号为CGMCCNo.21322、日本假黄单胞菌RFPth‑1保藏编号为CGMCCNo.21323、洋葱伯克氏菌RFBur‑1保藏编号为CGMCCNo.21324、嗜麦芽寡养单胞菌RFSte‑1保藏编号为CGMCCNo.21325、解淀粉芽孢杆菌RFBac‑1保藏编号为CGMCCNo.21326、土壤溶杆菌RFLys‑1保藏编号为CGMCCNo.21327、路德维希肠杆菌RFEnt‑1保藏编号为CGMCCNo.21328；其特征在于所述的混合发酵方法包含以下步骤:(i)先将菌株RFPth‑1、RFSte‑1、RFBur‑1和RFAci‑1种子液接种到基础培养基中，设置培养温度为35‑37℃、pH为7.0‑7.5，发酵2h；(ii)将菌株RFPse‑1种子液接种到发酵液中，用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5，设置培养温度为35‑37℃，发酵4h；(iii)将菌株RFLys‑1种子液接种到发酵液中，第一次补充蔗糖至基础培养基浓度，用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5，设置培养温度为37℃，发酵3‑6h；(iv)将菌株RFBac‑1和RFEnt‑1种子液等量混合接种到基础培养基中，第二次补充蔗糖至基础培养基浓度，用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5，设置培养温度为35℃，发酵15h；每1000ml基础培养基配方为：蔗糖8‑10g、玉米浆粉18‑22g、K2HPO43‑5g、ddH2O1000ml；优选蔗糖10g、玉米浆粉20g、K2HPO43g、ddH2O1000ml。2.根据权利要求1所述的混合发酵方法，其特征在于所述合成菌群的菌株种子液制备是将复合菌群的单菌以1％的接种量接种到100mlTSB培养基中，在30℃、170rpm的恒温中摇床培养至OD600＝1所得。3.根据权利要求1所述的混合发酵方法，其特征在于各单菌种子液接种到基础培养基中的接种量为1％。4.根据权利要求1所述的混合发酵方法，其特征在于所述调节发酵体系pH值的缓冲液为酸性缓冲溶液和碱性缓冲溶液，每升所述的酸性缓冲溶液含K2HPO45.5g和KH2PO40.41g，NaOH调至pH为10；每升所述的碱性缓冲溶液含K2HPO48.34g和KH2PO40.87g、浓HCl调至pH为6。5.根据权利要求1‑4中任一项所述的混合发酵方法，其特征在于步骤(i)先将菌株RFPth‑1、RFSte‑1、RFBur‑1和RFAci‑1种