一种适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115261303A(43)申请公布日2022.11.01(21)申请号202210928553.8(22)申请日2022.08.03(71)申请人新疆农业大学地址830052新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区农大东路311号(72)发明人李晓斌杨开伦李超李倩陈晖臧长江马晨王彩蝶(74)专利代理机构山西木木三专利代理事务所(普通合伙)14128专利代理师颜思文(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书2页说明书6页附图6页(54)发明名称一种适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法(57)摘要本发明提供一种适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法。所述适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法包括以下步骤：S1：乳腺组织采集；S2：乳腺组织前处理；S3：乳腺组织的消化；S4：乳腺组织的接种；S5：细胞纯化；S6：细胞传代；S7：细胞冻存；S8：细胞复苏；S9：乳腺上皮细胞的鉴定。本发明提供的适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法具有通过酶消化法筛选出能够高效简便的分离培养出细胞活力强，能够稳定传代，具有正常泌乳功能的原代母马乳腺上皮细胞培养的优点。CN115261303ACN115261303A权利要求书1/2页1.一种适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：乳腺组织采集；S2：乳腺组织前处理；S3：乳腺组织的消化；S4：乳腺组织的接种；S5：细胞纯化；S6：细胞传代；S7：细胞冻存；S8：细胞复苏；S9：乳腺上皮细胞的鉴定。2.根据权利要求1所述的适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法，其特征在于，所述S1中具体步骤如下：母马采用泌乳中期的健康哈萨克母马，将母马麻醉后，使用碘伏溶液对母马乳房进行清洗，随后用75%的酒精进行消毒处理；使用手术刀割开表层皮肤组织，沿筋膜表面分离乳腺组织，环切乳腺，环切半径为2cm，环切深度皮下3cm；将所切割的乳腺组织放入含75%乙醇溶液的50mL离心管中约5‑10s立即取出，再用无菌1%PBS缓冲液冲洗，待洗去血渍和乳汁后，放入含2%PBS缓冲液的50mL无菌样品管，贴好封口膜，置于冰盒，带回实验室。3.根据权利要求2所述的适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法，其特征在于，所述S2中具体步骤如下：乳腺组织带回实验室后，将含有乳腺组织的50mL无菌样品管外部用75%酒精消毒，带入细胞间超净工作台；取出乳腺组织置于含有PBS缓冲液的培养皿中；用眼科剪和眼科镊剔除乳腺组织外部筋膜、脂肪组织和纤维束状结缔组织，即得到乳腺上皮细胞的实质组织；将得到的实质组织置于5mL离心管中，用眼科剪剪成糊状。4.根据权利要求3所述的适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法，其特征在于，所述S3中具体步骤如下：将糊状乳腺组织与同时含有0.1%Ⅰ型胶原酶和0.01%透明质酸酶的消化液按1:3的体积比置于50mL离心管中；将50mL离心管置于恒温震荡水浴锅中37℃恒温摇床，以100r/min的速度震荡消化，待大部分组织被消化后，加入等体积终止培养基终止消化。5.根据权利要求4所述的适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法，其特征在于，所述S4中具体步骤如下：将消化后的乳腺组织用100目细胞筛过滤，再用200目细胞筛过滤；过滤物置于15mL离心管中，1000r/min，离心5min；弃上清液，留细胞层，此过程若沉淀中有血清，则按1：3的比例加入红细胞裂解液，吹打均匀，裂解2min，1000r/min，离心5min；弃上清，加入5倍体积的PBS缓冲液，吹打均匀，1000r/min，离心3min，重复两次；弃上清液，留细胞沉淀；加入2mL完全培养基并吹打均匀，接种于T25培养瓶中，再补足完全培养基至4mL；将T25培养瓶置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每天观察细胞，每2d更换完全培养基。6.根据权利要求5所述的适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法，其特征在于，所述S5中具体步骤如下：乳腺上皮细胞培养过程中会有成纤维细胞混杂生长，根据其对胰蛋白酶敏感性的不同，将两者分离，待细胞铺满瓶底80%‑90%时，吸去瓶中培养基，用1%PBS漂洗2次；加入1mL的0.25%胰蛋白酶溶液，放入37℃、5%CO2培养箱中消化成纤维细胞；每隔2分钟观察一次；待成纤维细胞被消化后加入终止培养基终止消化，弃去瓶内消化液；再用PBS冲洗2次后，加入1mL的0.25%胰蛋白酶溶液继续消化未脱壁细胞，待细胞90%脱壁时，加入终止2CN115261303A权利要求书2/2页培养基终止消化；反复吹打瓶壁细胞使其脱壁，将细胞液于15mL离心管中，1000r/min，离心5min；去上清，加入适量完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，再补足完全培养基至4mL；于