一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器及方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115453107A(43)申请公布日2022.12.09(21)申请号202211046714.7(22)申请日2022.08.30(71)申请人浙江省农业科学院地址310021浙江省杭州市石桥路198号(72)发明人王柳俞静徐霞红何开雨权浩然(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200专利代理师林超(51)Int.Cl.G01N33/543(2006.01)G01N33/533(2006.01)G01N33/53(2006.01)G01N21/64(2006.01)权利要求书3页说明书6页附图3页(54)发明名称一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器及方法(57)摘要本发明公开了一种用于赭曲霉毒素A(OTA)检测的级联FRET适配体传感器及方法。包括供体纳米粒子和受体纳米粒子；供体纳米粒子外部修饰OTA适配体(Apt)；受体纳米粒子修饰OTA适配体的互补链，通过OTA适配体与互补链杂交，使受体纳米粒子能接受供体纳米粒子发射的荧光；受体纳米粒子的外部修饰受体荧光基团，能接受受体纳米粒子发射的荧光并实现自身的荧光发射，形成类似于级联传递的FRET传感器；OTA的存在使得适配体与互补链的杂交解离，从而导致供体纳米粒子的荧光无法传递到受体纳米粒子，受体荧光基团不被激发而无荧光发射。根据在供体纳米粒子的激发波长下受体探针上的荧光基团的荧光发射强度，可实现目标物检测。CN115453107ACN115453107A权利要求书1/3页1.一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，级联FRET适配体传感器由供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子交联得到，供体聚合物纳米粒子修饰有OTA适配体，受体聚合物纳米粒子修饰有cDNA和荧光受体基团。2.根据权利要求1所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，级联FRET适配体传感器的制备方法包括以下步骤：步骤1)分别合成供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子，供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子负载不同荧光染料；步骤2)在供体聚合物纳米粒子上修饰OTA适配体，在受体聚合物纳米粒子上修饰cDNA和受体荧光基团；步骤3)将步骤2的供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子通过DNA杂交实现交联，从而得到用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器。3.根据权利要求2所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，所述步骤(1)中：供体聚合物纳米粒子和受体聚合物纳米粒子的外壳均为叠氮/羧酸双官能团修饰的PMMA‑AspN3；供体聚合物纳米粒子内部包裹的染料为发射波长在500‑540nm的绿色阳离子染料与反离子的复合物；受体聚合物纳米粒子内部包裹的染料为激发波长在500‑540nm、发射波长在545‑600nm的黄色阳离子染料与反离子的复合物；所述绿色阳离子染料包括罗丹明110、罗丹明Green、罗丹明123中的一种；所述黄色阳离子染料包括罗丹明R18、TAMRA中的一种；所述反离子包括四苯基硼酸酯及其氟化类似物。4.根据权利要求2所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，所述供体聚合物纳米粒子或受体聚合物纳米粒子的合成方法具体为：将PMMA‑AspN3溶于乙腈中，在PMMA‑AspN3乙腈溶液中加入阳离子染料和反离子的复合盐，500‑1500rpm转速下震荡后快速加入合成缓冲液，超滤去除乙腈，用合成缓冲液洗涤三次，最终在超滤管中加入合成缓冲液超声1～5min，复溶得到负载染料的供体聚合物纳米粒子或受体聚合物纳米粒子；所述PMMA‑AspN3在乙腈中溶解的浓度为1～5mg/mL；所述复合盐溶于乙腈的浓度为0.5～1.5μg/μL；所述合成缓冲液的成分包括10‑50mMPBS或Tris，并包含10‑200mMNaCl、0‑30mMMgCl2、0‑30mMCaCl2。5.根据权利要求2所述的一种用于赭曲霉毒素A检测的级联FRET适配体传感器，其特征在于，所述步骤(2)具体为：在供体聚合物纳米粒子上修饰OTA适配体的方法为：将ssDNA与供体聚合物纳米粒子混合后，在25‑50℃温度下不搅拌避光反应5‑24h，降至室温；在受体聚合物纳米粒子上修饰cDNA和受体荧光基团的方法为：将修饰有DBCO基团的ssDNA、红色荧光染料与受体聚合物纳米粒子混合后，在25‑50℃温度下不搅拌避光反应5‑24h，降至室温；所述供体聚合物纳米粒子上修饰的ssDNA包括封闭DNA和OTA适配体，其中封闭DNA与OTA适配体比例为120:1‑60:1之间；2CN115453107A权利要求书2/3页所述受体聚合物纳米粒子上修饰的ssDNA包括封闭DNA和