一种催化偶联反应检测伏马毒素的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115524501A(43)申请公布日2022.12.27(21)申请号202211168035.7(22)申请日2022.09.23(71)申请人河南农业大学地址450046河南省郑州市郑东新区龙子湖高校园区15号(72)发明人李伟谢黎霞张浩王顺董朝沛胡建东吴建宇(74)专利代理机构郑州豫原知识产权代理事务所(普通合伙)41176专利代理师孙素姗(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N21/31(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图2页(54)发明名称一种催化偶联反应检测伏马毒素的方法(57)摘要本发明提供一种催化偶联反应检测伏马毒素的方法，以伏马毒素为检测对象，通过伏马毒素与微孔板上包被固定的抗原竞争结合对应伏马毒素的抗体，利用过氧化物辣根酶标二抗与伏马毒素抗体特异性结合形成酶复合物，之后在双氧水(H2O2)作用下，酶复合物催化4‑氨基安替比林(4‑AAP)和2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠(TOOS)进行偶联反应，最后对反应生成的偶联产物进行吸光度检测。本发明的方法解决了传统ELISA法进行伏马毒素检测时信号不太稳定，重复性差的问题；消除了反应后产物不稳定对实验结果的影响，同时提高检测结果的稳定性。CN115524501ACN115524501A权利要求书1/2页1.一种催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，以伏马毒素为检测对象，通过伏马毒素与微孔板上包被固定的抗原竞争结合对应伏马毒素的抗体，利用过氧化物辣根酶标二抗与伏马毒素抗体特异性结合形成酶复合物，之后在双氧水作用下，酶复合物催化4‑氨基安替比林和2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠进行偶联反应，最后对反应生成的偶联产物进行吸光度检测。2.根据权利要求1所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1、在微孔板上包被固定伏马毒素抗原；S2、将伏马毒素或含有伏马毒素的溶液与对应的伏马毒素抗体加入至包被固定有伏马毒素抗原的微孔板中，使伏马毒素和微孔板上包被固定的伏马毒素抗原分别与对应的伏马毒素抗体进行竞争性结合反应，再加入过氧化物辣根酶标二抗，利用过氧化物辣根酶标二抗与伏马毒素抗体特异性结合，得到酶复合物；S3、在双氧水作用下，酶复合物催化4‑氨基安替比林和2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠进行偶联反应，反应完成后进行吸光度检测。3.根据权利要求2所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，S3中，吸光度的检测波长为555nm。4.根据权利要求2所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，S2中，还包括洗板，所述洗板是在加入过氧化物辣根酶标二抗之后，用洗板液进行洗板，以去除溶液中未结合的过氧化物辣根酶标二抗。5.根据权利要求2所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，S3的具体操作为：向酶复合物中加入4‑氨基安替比林溶液、2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠溶液和H2O2‑乙酸钠缓冲液，进行催化偶联反应，反应完成后进行吸光度检测。6.根据权利要求5所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，4‑氨基安替比林溶液的浓度为50.0mM；2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠溶液的浓度为100mM；H2O2‑乙酸钠缓冲液pH为5.0，其中H2O2的浓度10.0mM，乙酸钠的浓度为150mM；酶复合物生成过程中加入的过氧化物辣根酶标二抗溶液与4‑氨基安替比林溶液、2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠溶液、H2O2‑乙酸钠缓冲液的体积比为1：1：1：1。7.根据权利要求2所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，该方法还包括：通过标准曲线来定量检测待测样品溶液中伏马毒素的含量。8.根据权利要求7所述的催化偶联反应检测伏马毒素的方法，其特征在于，通过标准曲线来定量检测待测样品溶液中伏马毒素含量的具体操作过程如下：步骤一、制备系列浓度的伏马毒素标准溶液；步骤二、将系列浓度的伏马毒素标准溶液与对应的伏马毒素抗体加入至包被固定有伏马毒素抗原的微孔板中，使伏马毒素标准品和微孔板上包被固定的伏马毒素抗原分别与对应的伏马毒素抗体进行竞争性结合反应，再加入过氧化物辣根酶标二抗，利用过氧化物辣根酶标二抗与伏马毒素抗体特异性结合，得到酶复合物；步骤三、在双氧水作用下，酶复合物催化4‑氨基安替比林和2‑羟基‑3‑间甲苯胺丙磺酸钠进行偶联反应，反应完成后对偶联产物进行吸光度检测；2CN115524501A权利要求书2/2页步骤四、以伏马毒素标准溶液浓度的对数值为横坐标，吸光度为纵坐标，拟合得到标准曲线线性回归方程；步骤五、将待测样品溶液按照步骤二～步骤三的方法检测吸光度，并代入步骤四的标准曲线线性回归方程，计算得到待测样品溶液的浓度。9