一种高效甘蔗转基因方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115747255A(43)申请公布日2023.03.07(21)申请号202211293203.5C12N5/04(2006.01)(22)申请日2022.10.21A01H4/00(2006.01)A01H5/00(2018.01)(71)申请人中国热带农业科学院热带生物技术A01H6/46(2018.01)研究所地址570100海南省海口市龙华区城西镇学院路4号申请人中国热带农业科学院三亚研究院(72)发明人王文治张树珍杨本鹏谭贤教冯翠莲王俊刚赵婷婷沈林波冯小艳(74)专利代理机构北京汇智英财专利代理有限公司11301专利代理师陈雅静(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)权利要求书3页说明书10页附图3页(54)发明名称一种高效甘蔗转基因方法(57)摘要本发明提供一种高效甘蔗转基因方法，属于植物生物技术领域，所述转基因方法是以脱毒甘蔗种苗诱导的甘蔗胚性愈伤组织作为受体材料，利用抗除草剂基因bar或除草剂基因CP4‑EPSPS作为筛选标记进行遗传转化，并分别用草铵膦或草甘膦进行抗性植株筛选，经过再生过程的持续筛选后，得抗性植株。利用本发明的转基因方法制备的抗性植株经抗性鉴定的阳性率分别达100%（草铵膦）和98%（草甘膦），平均转化效率单克胚性愈伤组织的遗传转化能获得10棵以上的转基因植株；本发明的转基因方法大幅度的提高了甘蔗遗传转化效率，大幅度提高了甘蔗转基因抗性植株分子检测的阳性率，简化了苗期分子检测方法，降低了实验成本。CN115747255ACN115747255A权利要求书1/3页1.一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述转基因方法包括以下步骤：1)胚性愈伤组织和工程菌液的制备：取甘蔗制备胚性愈伤组织；取含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株或含CP4‑EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株制备相应的农杆菌工程菌液；2)共培养胚性愈伤组织的制备：将胚性愈伤组织风干后，加入相应的农杆菌工程菌液进行第一次暗培养，然后经超声波处理，更换相应的农杆菌工程菌液进行真空处理，然后再经第二次暗培养，取出相应的培养后的胚性愈伤组织并吸干农杆菌工程菌液后，置于共培养培养基中进行第三次暗培养，得相应的共培养后的胚性愈伤组织；3)抗性植株的制备：共培养后的胚性愈伤组织移至恢复培养基中，经恒温暗恢复培养后，再转移至胚性愈伤组织筛选培养基中进行胚性愈伤组织筛选培养，所得相应的抗性愈伤组织转移至分化筛选培养基中进行分化筛选培养，并在分化筛选培养结束后挑取长势较好的幼芽转移至生根筛选培养基中进行生根筛选培养，在生根筛选培养过程中间更换生根筛选培养基，并在更换生根筛选培养基时挑取较健壮的植株进行生根培养，生根培养完成后，去除侧生芽，即得相应的抗性植株。2.根据权利要求1所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述抗性植株经相应的抗性鉴定，得相应的抗性结果为阳性的转基因植株；所述转基因植株的苗期分子检测方法包括以下步骤：将转基因植株进行开放式练苗，待转基因植株叶片直立后，相应的喷洒田间使用浓度的草铵膦除草剂或草甘膦除草剂进行抗除草剂测试。3.根据权利要求2所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述抗性鉴定是取抗性植株，剪取叶片组织研磨后，利用Bar基因试剂盒或EPSPS基因试剂盒进行检测。4.根据权利要求1‑3中任一项所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，所述农杆菌工程菌液的制备过程包括以下步骤：取携带含Bar基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株或CP4‑EPSPS基因筛选标记质粒植物表达载体的EHA105农杆菌菌株相应的置于含卡那霉素的固体YEP平板培养基或含壮观霉素的固体YEP平板培养基中划线培养至长出相应的单菌落，挑取相应的单菌落置于含相应抗生素的液体YEP培养基中震荡培养，离心收集相应的农杆菌菌体，再通过启动培养基进行悬浮培养，并稀释后，即得相应的所述农杆菌工程菌液。5.根据权利要求4所述的一种高效甘蔗转基因方法，其特征在于，含卡那霉素的固体YEP平板培养基是在每升YEP培养基中添加50mg的卡那霉素、200～300μmol乙酰丁香酮和14～16g琼脂，并调节pH值至6.8～7.2；含壮观霉素的固体YEP平板培养基是在每升YEP培养基中添加100mg的壮观霉素、200～300μmol乙酰丁香酮和14～16g琼脂，并调节pH值至6.8～7.2；含卡那霉素的液体YEP培养基是在每升YEP培养基中添加50mg的卡那霉素和200～300μmol乙酰丁香酮，并调节pH值至6.8～7.2；含壮观霉素的液体YEP培养基是在每升YEP培养基中添加100mg的壮观霉素和200～300μmol乙酰丁香酮