一种杧果胚性细胞的遗传转化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115772537A(43)申请公布日2023.03.10(21)申请号202211644612.5(22)申请日2022.12.20(71)申请人中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所地址571101海南省海口市城西学院路4号(72)发明人丛汉卿王明珠陈业渊乔飞霍婷(74)专利代理机构广州海心联合专利代理事务所(普通合伙)44295专利代理师王洪娟(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N5/04(2006.01)C12N5/00(2006.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图6页(54)发明名称一种杧果胚性细胞的遗传转化方法(57)摘要本发明公开了一种杧果胚性细胞的遗传转化方法，包括以下步骤：(S1)取杧果果核中的胚轴组织接种至愈伤培养基中进行培养；(S2)将愈伤组织转移至液体增殖培养基中进行继代增殖培养，获得杧果胚性悬浮细胞；(S3)制备农杆菌重悬液；(S4)将杧果胚性悬浮细胞经预处理；(S5)将预处理杧果胚性悬浮细胞与农杆菌重悬液混合进行转化培养，将转化后的悬浮细胞先接种至Paul固体培养基中进行暗培养，再转移至含有潮霉素、头孢噻肟和植物凝胶的Murashige和Skoog培养基中进行选择培养，获得杧果胚性细胞遗传转化体系。该方法通过建立杧果胚性细胞培养系，用杧果胚性细胞为转化受体，建立高效及适应性广的杧果遗传转化体系。CN115772537ACN115772537A权利要求书1/2页1.一种杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是包括以下步骤：(S1)以未成熟的杧果果实作为外植体，将所述外植体消毒后取杧果果核中的胚轴组织接种至愈伤培养基中进行培养，获得愈伤组织；(S2)将愈伤组织转移至液体增殖培养基中进行继代增殖培养，获得杧果胚性悬浮细胞；(S3)将农杆菌在固体板上划线培养，挑取单菌落，接种至含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中进行活化培养，将活化好的菌液接种至LB液体培养基中培养后，离心，弃上清，加入含有乙酰丁香酮的Paul培养基重悬，得农杆菌重悬液；(S4)将步骤(S2)中的杧果胚性悬浮细胞用Paul培养基清洗，然后加入含有乙酰丁香酮的Paul培养基，混匀，得预处理杧果胚性悬浮细胞；(S5)将步骤(S4)中预处理杧果胚性悬浮细胞与步骤(S3)中农杆菌重悬液混合进行转化培养，将转化后的悬浮细胞先接种至Paul固体培养基中进行暗培养，然后再转移至含有潮霉素、头孢噻肟和植物凝胶的Murashige和Skoog培养基中进行选择培养，获得杧果胚性细胞遗传转化体系。2.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S1)中所述愈伤培养基为添加有0.5～3mg/L2,4‑D、0.5～3mg/L玉米素，3.0％,w/w蔗糖和0.25％～0.30％,w/w植物凝胶的Murashige和Skoog固体培养基；培养条件为25～28℃、pH为5.8～5.9、黑暗，培养时间为40～60天。3.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S2)中所述液体增殖培养基为添加有2～3mg/L2,4‑D、1～3mg/L玉米素、3.0～4.0％,w/w蔗糖的Murashige和Skoog液体培养基上进行培养；培养条件为25℃、pH为5.8～5.9、150～220rpm进行震荡黑暗培养，每5～7天继代一次。4.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S3)中所述农杆菌为LBA4404；步骤(S3)中所述卡那霉素的浓度为100～200mg/L，所述利福平的浓度为20～30mg/L；培养条件为150～220rpm下震荡培养，培养条件为28～30℃、黑暗培养16～20小时。5.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S3)中将活化好的菌液接种至LB液体培养基中培养，培养条件为28～30℃，150～220rpm，震荡培养至OD600＝0.5～0.7；离心时转速为8000rpm/min，离心时间为8～10分钟；所述乙酰丁香酮的加入量为10～20μL，浓度为50～100μmol/L。6.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S3)中～(S4)中所述Paul培养基为含有10％，w/w蔗糖的Murashige和Skoog培养基。7.根据权利要求1所述的杧果胚性细胞的遗传转化方法，其特征是：步骤(S4)中用800～1000mL含有10％，w/w蔗糖的Murashige和Skoog培养基清洗，每次用200～300mL，清洗4～5次；然后加入15～20mL含有乙酰丁香酮的Paul培养基，混匀，其中所述乙酰丁香酮的加入量为10～20μL，浓度为5