一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115807052A(43)申请公布日2023.03.17(21)申请号202211614011.X(22)申请日2022.12.15(71)申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号(72)发明人彭帮柱孟超帆(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师黄明光(51)Int.Cl.C12Q1/04(2006.01)C12N1/14(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书14页附图9页(54)发明名称一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用(57)摘要本发明提供了一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供了一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法，与传统培养方法相比，可以节省原料30倍的培养基，同时整个筛选过程仅仅需要8天，便可实现同时对四五百到上千株预筛高产DHA单菌落进行筛选，大大缩短了筛选时间。而且，本发明首次利用深孔板发酵模拟摇瓶发酵，显著提高了筛选通量和筛选效率。通过试验可知，利用本发明述筛选方法最终得到一株EU432裂殖壶菌，经三角瓶发酵DCW、脂质产量和DHA产量分别达到了39.71g/L、24.93g/L和8.90g/L，相较于原始菌株脂质产量和DHA产量分别提升了8.53％和21.58％。CN115807052ACN115807052A权利要求书1/1页1.一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：挑取潜在高产诱变菌株于48深孔板进行初筛发酵培养，得到裂殖壶菌菌悬液；在含有二甲基亚砜溶液的96深孔板中依次添加所述裂殖壶菌菌悬液和尼罗红染液，测定OD660以及水浴染色后测定的裂殖壶菌荧光强度FI，选择FI/OD660最大的菌株便可得到拟高产菌株；将所述拟高产菌株添加到48深孔板中进行复筛发酵培养，通过测定所述发酵产物中的DHA含量即可筛选得到高产DHA的裂殖壶菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述深孔板包括发酵孔和盖板；所述盖板包括上、中、下三层，所述上层为不锈钢板，所述中层为硅胶垫，所述下层为滤膜材料。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵孔的体积为2.2‑7mL。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述不锈钢板和硅胶垫上均匀分布有透气孔，所述透气孔的孔径为1.5‑6mm；所述滤膜材料的孔径为0.22μm。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述潜在高产诱变菌株由诱变后的裂殖壶菌涂布于含有抑制剂的固体筛选培养基筛选所得。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有抑制剂的固体筛选培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖5.0％、蛋白胨0.2％、酵母粉0.5％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、海水晶2.0％、琼脂2％、三氯生0.0002895％、精恶唑禾草灵0.036178％、碘乙酸0.005％。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水浴在暗处进行，所述水浴的温度为45℃，时间为20min。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初筛培养的条件为：温度25℃条件下，200r/min培养28小时。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复筛发酵培养的培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖10％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、酵母浸粉1.5％、蛋白胨0.5％、硫酸钠0.3％、硝酸钠0.3％。10.权利要求1‑9任意一项所述的方法在裂殖壶菌育种中的应用。2CN115807052A说明书1/14页一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用。背景技术[0002]二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)是一种ω‑3多不饱和脂肪酸，具有促进婴幼儿大脑生长发育、维持视网膜正常功能、癌症治疗、抗炎、预防心血管疾病等功效。目前，DHA主要来源于鱼油和微藻油当中，由于鱼油的纯化工艺复杂、对海洋资源的消耗大以及脂质内易残存海洋环境污染物等因素，使得DHA藻油的需求量逐渐增加，其中最有待解决的问题便是发酵成本以及提升产量的问题，以满足目前世界对DHA需求的快度增长。裂殖壶菌作为生产DHA重要的工业菌株，从经济上来讲，裂殖壶菌中得到DHA藻油的成本依然是鱼类中得到鱼油的1～2倍。为降低生产成本，目前相关研究主要集中在菌种选育、发酵过程优化、油脂提取优化及基因编辑等方面。[0003]有研究利用尼罗红染色作为高通量筛选方法，但前期培养均需要消耗大量培养基，并且染色方法没有优化而效率不高。还有一些报道用流式细胞仪通过荧光染色进行细胞分选，David筛选出的菌株比野生菌株脂质产量提升了1