一种无肌间刺银鲫的创制方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115943930A(43)申请公布日2023.04.11(21)申请号202211723915.6C12N15/113(2010.01)(22)申请日2022.12.30C12N15/873(2010.01)C12N15/89(2006.01)(71)申请人中国科学院水生生物研究所A01K61/10(2017.01)地址430070湖北省武汉市武昌区东湖南C12N15/12(2006.01)路7号申请人华中农业大学(72)发明人甘瑞海桂建芳周莉高泽霞李志王忠卫李熙银汪洋张晓娟佟金凤(74)专利代理机构合肥和瑞知识产权代理事务所(普通合伙)34118专利代理师王挺(51)Int.Cl.A01K67/027(2006.01)C12N9/22(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称一种无肌间刺银鲫的创制方法(57)摘要本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，尤其涉及一种无肌间刺银鲫的创制方法。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，向银鲫鱼卵注射含有runx2b‑A和runx2b‑B两个特异敲除靶位点的sgRNA与Cas9mRNA混合物，注射后的银鲫鱼卵经两次雌核生殖，在F1代出现所需无肌间刺银鲫。本发明方法实现了在F1代就能快速创制runx2b所有等位基因都被编辑的无肌间刺银鲫，为银鲫的基因编辑育种提供技术支撑，也为其它养殖鱼类精准设计育种提供了重要的参考价值。CN115943930ACN115943930A权利要求书1/1页1.一种无肌间刺银鲫的创制方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，向银鲫鱼卵注射含有runx2b‑A和runx2b‑B两个特异敲除靶位点的sgRNA与Cas9mRNA混合物，注射后的银鲫鱼卵经两次雌核生殖，在F1代出现所需无肌间刺银鲫；所述runx2b‑A的靶位点序列如SEQIDNO:1所示，runx2b‑B的靶位点序列如SEQIDNO:2所示。2.如权利要求1所述的一种无肌间刺银鲫的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.获取浓度为1000～1500ng/μL的runx2b‑A和runx2b‑B两个特异敲除靶位点的sgRNA，制备浓度为1500～2000ng/μL的Cas9mRNA，备用；S2.分别取S1中的runx2b‑AsgRNA、runx2b‑BsgRNA和Cas9mRNA各1μL混合，再加入2μL无核酸酶水混合均匀，用于注射鱼卵，5μL混合物注射500～2500粒银鲫成熟鱼卵；S3.注射后鱼卵与兴国红鲤精子受精，雌核生殖获得F0代；S4.取F0代中肌间刺数目减少表型的银鲫，再次通过雌核生殖方式获得F1代，F1代中即出现所需无肌间刺银鲫。3.如权利要求2所述的一种无肌间刺银鲫的创制方法，其特征在于，获得F0代中肌间刺数目减少表型的银鲫的方法为：在F0代银鲫孵化后210天，使用X光成像仪或活体Micro‑CT影像系统进行筛选。4.如权利要求2所述的一种无肌间刺银鲫的创制方法，其特征在于，所述S4中雌核生殖的具体操作为：银鲫成熟的卵子与兴国红鲤雄鱼的精子混合受精，产生银鲫全雌性F1代。5.如权利要求2所述的一种无肌间刺银鲫的创制方法，其特征在于，所述runx2b‑AsgRNA和runx2b‑BsgRNA的制备方法为：分别合成runx2b‑A和runx2b‑B的特异靶位点引物，以所述靶位点引物和pUC19‑gRNA质粒为模板，进行PCR扩增得到runx2b‑A‑sgRNA和runx2b‑B‑sgRNA片段，再对所述runx2b‑A‑sgRNA和runx2b‑B‑sgRNA片段进行纯化及回收，得到最终所需的runx2b‑AsgRNA和runx2b‑BsgRNA；所述runx2b‑A的特异靶位点引物的正向引物序列如SEQIDNO:3所示，所述runx2b‑B的特异靶位点引物的正向引物序列如SEQIDNO:4所示，runx2b‑A和runx2b‑B的特异靶位点引物的反向引物序列如SEQIDNO:5所示。6.如权利要求5所述的一种无肌间刺银鲫的创制方法，其特征在于，所述纯化及回收通过体外转录和氯化锂沉淀法进行。2CN115943930A说明书1/6页一种无肌间刺银鲫的创制方法技术领域[0001]本发明涉及鱼类遗传育种技术领域，尤其涉及一种无肌间刺银鲫的创制方法。技术背景[0002]肌间刺(intermuscularbone)是位于硬骨鱼类肌膈组织中的小针状骨，在大多数淡水鱼类中普遍存在，尤其是养殖鲤科鱼类中(Nieetal.,2019)。由于肌间刺的存在给消费者带来潜在的伤害风险，无肌间刺的产生已成为鱼类遗传育种中的一个热点问题。早期鱼类肌间刺的研究大多数主要集中在研究肌间刺的数量、形态和骨化方