合方鲫肌间骨骨化过程及形态学观察.docx

合方鲫肌间骨骨化过程及形态学观察打开文本图片集DOI：10.7612/j.issn.10002537.2022.02.006摘要利用整体骨骼染色和形态学解剖方法，对合方鲫仔稚鱼肌间骨出现时期、形态发育以及成鱼肌间骨数目、形态、分布进行观察.结果表明合方鲫肌间骨是在主体骨骼完全形成后开始出现，随着生长肌间骨形态逐渐复杂化；肌间骨从尾部往躯体前端逐渐出现，形态由简单到复杂，尾部末端骨化明显；肌间骨数量和形态在体轴中呈现梯度差异.关键词合方鲫；肌间骨；形态发育OssificationProcessandMorphologyofIntermuscularBonesinHybridsCrucianCarpWANGJing，ZHANGQiao，ZHAOQiong，ZHAOFeiyue，HANHui，LINYannan，LOUKaikun，LIUShaojun*（StateKeyLaboratoryofDevelopmentalBiologyofFreshwaterFish，CollegeofLifeSciences，HunanNormalUniversity，Changsha410081，China）Keywordshybridcruciancarp；intermuscularbone；morphologicaldevelopment鲫属鲤科，鲤亚科，鲫属.湖南师范大学鱼类发育生物学研究室以雌性日本白鲫和雄性红鲫为亲本进行杂交，获得了杂交子代二倍体合方鲫.二倍体合方鲫体色为青灰色，具有生长速度快、肉质鲜嫩、抗逆性强等特征[8].利用雌性二倍体合方鲫与雄性四倍体鲫鲤（红鲫（♀）×鲤鱼（♂））交配还培育出不育的三倍体合方鲫.本研究选取二倍体和三倍体合方鲫为材料，利用整体骨骼染色法对合方鲫仔稚鱼肌间骨的发育过程进行系统观察，并对成鱼进行形态解剖，分析不同倍性的合方鲫肌间骨数目和形态差异，了解合方鲫肌间骨骨化的基本规律以及形态分布特点，为后期基因敲除培育无肌间骨的优质鲫奠定基础.1材料与方法1.1实验材料本研究中的二倍体合方鲫和三倍体合方鲫均取自教育部“多倍体繁殖及育种技术”工程研究中心.从受精后13天开始，每隔3天选取发育正常的仔、稚鱼作为样本用于骨骼染色.每隔3天取一次样，每次每个样本10尾，用4%多聚甲醛固定，取至肌间骨全部出现为止.用于解剖与形态观察的样本按月龄取材，每次8尾.1.2合方鲫仔、稚鱼整体骨骼染色结合柯中和[5]及吕耀平[6]等人的实验方法，对合方鲫仔、稚鱼进行整体骨骼染色.具体操作步骤如下：（1）用去离子水漂洗样本3次，每次30min，去除多聚甲醛；（2）将仔鱼放置于TBST溶液中（50mmol/LTrispH7.4，150mmol/LNaCl，体积分数为0.1%的TritonX100）处理30min，用去离子水漂洗10min，以去除残余的TBST溶液；（3）转移标本至1%KOH溶液中浸泡10～30min，使组织透明（具体时间根据鱼体大小调整）；（4）经透明的标本转移至新的1%KOH溶液中，滴加茜素红染色液（1g茜素红溶于100mL1%KOH溶液中配制成染色液），直至溶液颜色变为深紫色，染色1～3h（具体时间根据鱼体大小和季节温度调整），倒掉染色液，用1%KOH溶液洗去组织中残余的染色液；（5）用1%KOH溶液覆蓋标本，加入少量体积分数为1%的双氧水，放置在强光下照射，褪去色素，当标本表面出现气泡时终止反应，倒掉溶液，加1%KOH溶液漂洗（若鱼体透明度足够或太小则不需要）.染色好的标本放置于倒置显微镜下观察，并拍照记录.实验鱼经测量后，用纱布将整个鱼体包好，置沸水锅中煮10～15min（具体时间根据鱼体大小调整）.取出，冷却后去除纱布，用镊子小心剥去鱼皮.将鱼体以脊椎骨为界划分为轴上肌和轴下肌两个部分，从尾部向头部顺着肌节用镊子小心地剥开肌肉，依次取出肌间骨.肌间骨按照按从头部到尾部的顺序排列整齐，鱼体左侧肌间骨在上，右侧肌间骨在下.然后用数码相机对已排列有序的肌间骨进行拍照记录.2结果2.1二倍体合方鲫和三倍体合方鲫肌间骨的发育和骨化时间通过肌间骨染色观察后发现：受精后23dpf（dayspostfertilization）内仔稚鱼主骨骼逐渐形成，但没有肌间骨存在（图1A）；26dpf的样本中，仔稚鱼主轴骨骼及附肢骨骼已骨化完全，并首次在尾部出现肌间骨，其形态呈“"”形；30dpf，尾部处出现多条肌间骨，且都呈“|”形，之后肌间骨不断由尾部向头部方向分化出现（图1B）；33dpf，肌间骨明显增多，已生长至背鳍后端且尾部出现“Y”形肌间骨（图1D）；40dpf，肌间骨已明显骨化，形态清晰，数目增多，长度增长，躯干轴上部分出现大量“|”形肌间骨，尾部出现较多“Y”形肌间骨（图1E）；在53dpf，肌间骨全部出现.A.20dpf