一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004705A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202210788910.5A01H1/02(2006.01)(22)申请日2022.07.06A01H1/04(2006.01)(71)申请人安徽农业大学地址230000安徽省合肥市长江西路130号(72)发明人程备久王子萌范军顾龙江马庆李晓玉武建东王玉蔡荣号江海洋(74)专利代理机构合肥中谷知识产权代理事务所(普通合伙)34146专利代理师杜瑶(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/65(2006.01)A01H6/46(2018.01)A01H5/00(2018.01)权利要求书2页说明书7页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法及其应用，属于基因工程和转基因技术领域，本发明通过将颜色或荧光筛选标记性状和单倍体诱导性状导入具有高效遗传转化能力的自交系中，利用分子标记、颜色或荧光标记及单倍体诱导率的测定进行筛选，获得含有颜色或荧光筛选标记、具有单倍体诱导特性、且能高效遗传转化的单倍体诱导系，为无基因型限制的玉米基因编辑诱导系。利用该无基因型限制的玉米基因编辑诱导系进行基因编辑育种，可以突破基因编辑育种转化难、周期长和带有非编辑基因型遗传累赘的弊端，大大提高基因编辑育种的效率，节约育种成本，对实现各种优良自交系高效基因编辑育种具有极大的应用价值。CN116004705ACN116004705A权利要求书1/2页1.一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法，其特征在于，将颜色或荧光筛选标记性状和单倍体诱导性状导入具有高效遗传转化能力的自交系中，利用分子标记、颜色或荧光标记及单倍体诱导率的测定进行筛选，获得含有颜色或荧光筛选标记、具有单倍体诱导特性、且能高效遗传转化的单倍体诱导系，为无基因型限制的玉米基因编辑诱导系。2.根据权利要求1所述的一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：(Ⅰ)以具有高效遗传转化能力的自交系为母本，以含R1‑nj基因颜色标记的玉米单倍体诱导系为父本，进行杂交，获得F1杂交种子；(Ⅱ)以母本自交系品种为轮回亲本进行回交，从回交后代中选取紫色糊粉层和盾片籽粒，并利用分子标记鉴定含有单倍体诱导能力的Zmpla1，且表型与轮回亲本相近的单株继续回交4‑5代；(Ⅲ)对回交第4代以上的后代进行自交筛选pla1pla1纯合体,测定单倍体诱导率，筛选具有高单倍体诱导特性的纯合单株，获得无基因型限制的玉米基因编辑诱导系。3.根据权利要求2所述的一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法，其特征在于，含R1‑nj基因颜色标记的玉米单倍体诱导系包括农大高诱5号(CAU5)、JKY043、吉高诱系3号中的任意一种。4.根据权利要求1所述的一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法，其特征在于，包括以下步骤：(i)以具有高效遗传转化能力的自交系作为受体，构建ZmPLA1和ZmDMP基因敲除载体，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对受体中的ZmPLA1和ZmDMP两个基因进行双敲除，对敲除植株进行自交筛选纯合体，获得单倍体诱导系；构建双色荧光表达载体并转化受体，获得双色荧光筛选标记的转基因植株；(ii)将单倍体诱导系与双荧光标记转基因植株进行杂交、自交，选择含有双色荧光筛选标记、敲除突变基因Zmpla1和Zmdmp、且不含Cas9元件的纯合体，并进行单倍体诱导能力测试，筛选具有高单倍体诱导能力的双荧光标记的单倍体诱导系，为无基因型限制的玉米基因编辑诱导系。5.根据权利要求4所述的一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法，其特征在于，所述双色荧光筛选标记为胚表达GFP和胚乳糊粉层表达RFP。6.根据权利要求1所述的一种无基因型限制的玉米基因编辑诱导系的创制方法，其特征在于，具有高效遗传转化能力的自交系指的是农杆菌高效转化自交系，包括玉米CM1、CM25、B104自交系中的任意一种。7.一种如权利要求1‑6任一所述创制方法构建获得的无基因型限制的玉米基因编辑诱导系在基因编辑育种中的应用。8.一种基因编辑育种方法，其特征在于，利用如权利要求1‑6任一所述无基因型限制的玉米基因编辑诱导系进行基因编辑育种，具体步骤包括：(1)以所述无基因型限制的玉米基因编辑诱导系作为受体，构建待编辑自交系靶基因sgRNA的基因编辑载体，并转化至受体中，获得转化植株，所述转化植株为含有基因编辑元件的单倍体诱导系；2CN116004705A权利要求书2/2页(2)以任意待编辑的玉米自交系为母本，与步骤(1)转化植株的