一种层出镰刀菌的检测方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004878A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202210803519.8C12N15/11(2006.01)(22)申请日2022.07.07C12R1/77(2006.01)(71)申请人云南省烟草农业科学研究院地址650000云南省昆明市圆通街33号(72)发明人盖晓彤冯智宇姜宁卢灿华夏振远马俊红户艳霞代快王继明韩天华(74)专利代理机构成都市鼎宏恒业知识产权代理事务所(特殊普通合伙)51248专利代理师张勋(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/04(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种层出镰刀菌的检测方法及其应用(57)摘要本发明涉及一种层出镰刀菌的检测方法及其应用，所述的检测方法包括特异性引物组：Fe‑EF‑spec1F/Fe‑EF‑spec1R。本发明有益效果为，1、现有技术中没有针对PCR检测烟草镰刀菌根腐病病原菌层出镰刀菌的特异性引物，本发明实现了零的突破；2、本发明研究筛选出的引物具有极高的准确度和特异性；3、综合使用本发明的方法，其最大灵敏度可达0.1ng/μL；4、本发明的应用在于检测疑似被层出镰刀菌侵染的烟株最小时间为24小时；5、本发明能在接种层出镰刀菌后早期检测到病原菌，达到烟草镰刀菌根腐病早期检测的目的，对于烟草镰刀菌根腐病的早期检测，预防和控制具有非常重要的意义和重大的经济意义。CN116004878ACN116004878A权利要求书1/1页1.一种层出镰刀菌的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括特异性引物组：正向引物Fp‑EF‑spec1F：5′‑ATCTGGCGGGGTACATCTTGG‑3′；反向引物Fp‑EF‑spec1R：5′‑AGGTTGTGGACAGGAAAGG‑3′。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的特异性引物组Fe‑EF‑spec1F/Fe‑EF‑spec1R对应的扩展片段大小为293bp；序列为ATCTGGCGGGGTACATCTTGGAAGACAACATGCTGACATCGCTTCACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATCGACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTAGTCACTTTCCCTTCGATCGCGCGTCCTCTGCCCACCGATTTCACTTGCGATTCGAAACGTGCCTGCTACCCCGCTCGAGACCAAAAATTTTGCGATATGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCATTTACCCCGCCACTCGAGCGATGGGCGCGTTTTTGCCCTTTCCTGTCCACAACCT。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：S1：提取待检测样品DNA；S2：以待测样品为DNA为模板，采用一对引物进行PCR扩增；S3：扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中提待检测样品DNA的具体步骤如下：S11：称取待检测样品0.1g左右，加液氮在研钵中用研磨棒研磨成细末，将细末转移至离心管中，加入600μL预热至65℃的CTAB提取液，颠倒混匀，65℃水浴30～60min；所述步骤S11中的CTAB提取液含2％巯基乙醇；S12：取出离心管冷却至室温，加入600μL氯仿：异戊醇溶液，振荡混匀，12000rpm离心15min，取400μL上清液移至离心管中；所述步骤S12中的氯仿：异戊醇体积比为24:1；S13：取上清液离心管中，加入等倍体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，‑20℃放置30min以上，12000rpm离心10min；S14：去掉上清液，加入70％无水乙醇清洗1次，12000rpm离心10min；S15：去掉上清液，加入95％无水乙醇再清洗1次，12000rpm离心5min，室温干燥后用适量无菌ddH2O溶解沉淀的DNA，‑20℃保存备用。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增的反应体系总体积为25μL，包括10×TaqPCRbuffer2.5μL，2.0μLdNTP各0.25mmol/L，1.0UTaq聚合酶‑35U/μL，1.0μL上下游引物5×10mmol/L，1μL模板DNA，无菌ddH2O补足至25μL。6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸7min。7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤