绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102492706A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102492706A(43)申请公布日2012.06.13(21)申请号201110407055.0C12N1/21(2006.01)(22)申请日2011.12.08C12N1/19(2006.01)A23L2/84(2006.01)(71)申请人大连理工大学C12R1/19(2006.01)地址116024辽宁省大连市甘井子区凌工路C12R1/84(2006.01)2号(72)发明人杨青姜秀萍贾秋磊杨君刘田(74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司21212代理人贾汉生(51)Int.Cl.C12N15/56(2006.01)C12N9/26(2006.01)C12N15/63(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/81(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书1717页页序列表序列表88页页附图附图22页页(54)发明名称绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其应用(57)摘要本发明公开一种绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶(PG)的基因序列和一种制备该酶的方法。首先提取绿盲蝽总RNA，根据该酶的保守序列设计引物，利用RT-PCR方法扩增获得3个PG的同源基因序列，再利用RACE实验，获得5′和3′的未知序列。最后利用大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统分别进行了该酶的重组表达、纯化及性质分析。本发明首先解决了绿盲蝽的多聚半乳糖醛酸酶的基因序列获取问题，还首例解决了昆虫来源多聚半乳糖醛酸酶的重组表达问题。在食品(果汁榨取)、油料萃取、中药药材处理、造纸工业及低聚果胶保健产品等方面有应用前景。另外，针对该酶的抑制剂还可作为对刺吸式害虫的防治策略，从而达到对目标害虫的防治。CN1024976ACN102492706A权利要求书1/1页1.绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：10或SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示。2.权利要求1所述的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列依次为SEQIDNO：13或SEQIDNO：14或SEQIDNO：15所示。3.含有权利要求1所述的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：其为原核表达载体或者真核表达载体。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：原核表达载体为大肠杆菌表达载体pET-28a(+)。6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：真核表达载体为毕赤酵母表达载体pPIC9。7.由权利要求5或6所述的表达载体所转化得到的重组菌株。8.一种利用权利要求7所述重组菌株制备绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括如下步骤：设计引物扩增上述绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因；构建含有上述绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的表达质粒；培养用该质粒所转化的宿主细胞，经过筛选得到菌株；培养菌株，诱导蛋白表达；分离并纯化所表达的蛋白。9.权利要求2所述的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶蛋白在食品领域、造纸工业领域的应用。2CN102492706A说明书1/17页绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因、含有该基因的表达载体的构建、该基因在宿主细胞中的蛋白表达。背景技术[0002]多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases，PG)属于果胶酶(pectolyticenzymeorpectinase)的一种，其在应用上，具有与果胶酶相似的特性。[0003]果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，其大致分为果胶水解酶、果胶裂解酶、果胶酯酶和原果胶酶等，其中果胶水解酶又可分为多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases，PG)、多聚半乳糖醛酸甲酯水解酶(polymethylgalacturonases，PMG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶等。[0004]随着对果胶及果胶酶研究的日益深入，其应用领域已逐渐拓宽.尽管如此，就果胶酶的高效、多功能特点而言，其应用尚有较大的发展空间。[0005]果胶酶的应用性研究：[0006]1.利用果胶酶降解植物细胞的细胞壁，可用于果蔬汁的生产，果酒的澄清等。[0007]2.在油料萃取方面，将果胶酶和纤维素酶、半纤维素酶结合使用，可破坏油料作物的细胞壁，便于油料的释放，从而提高萃取率、提高油料的稳定性。[0008]3.中药药材处理方面，可利用果胶酶生产的提取物有：银杏叶提取物、大蒜油浓缩液、蘑菇浓缩液、人参浆、当归浸膏、甘草液等.另外，在金耳多糖、香菇多糖、金针菇多糖、山楂叶总黄酮等的提取中也使用了果胶酶。利用酶类提取，不仅可提高萃取率，还可提高纯度。[0009]