绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102876692A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102876692A(43)申请公布日2013.01.16(21)申请号201210391780.8C12N15/63(2006.01)(22)申请日2012.10.16C12N1/15(2006.01)C12N1/19(2006.01)(66)本国优先权数据C12N1/21(2006.01)201110407055.02011.12.08CN(71)申请人大连理工大学地址116024辽宁省大连市甘井子区凌工路2号(72)发明人杨青姜秀萍贾秋磊杨君刘田(74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司21212代理人贾汉生李馨(51)Int.Cl.C12N15/56(2006.01)C12N9/26(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书2020页页序列表序列表1010页页附图附图55页页(54)发明名称绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其应用(57)摘要本发明公开一种绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶(PG)的基因序列和一种制备该酶的方法。首先提取绿盲蝽总RNA，根据该酶的保守序列设计引物，利用RT-PCR方法扩增获得3个PG的同源基因序列，再利用RACE法获得5′和3′的未知序列。最后以PG1代表，利用毕赤酵母表达系统进行该酶的重组表达、分离纯化及酶活性分析。本发明首先解决了绿盲蝽的多聚半乳糖醛酸酶的基因序列获取问题，还首例解决了昆虫来源多聚半乳糖醛酸酶的重组表达问题。本发明获得的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶具有果胶分解活性。因此，凡是涉及到植物果胶方面的应用，如食品（果汁榨取）、油料萃取、中药药材处理、造纸工业及低聚果胶保健产品等方面，该酶都具有应用前景。CN1028769ACN102876692A权利要求书1/1页1.绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：10或SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示。2.权利要求1所述的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列依次为SEQIDNO：13或SEQIDNO：14或SEQIDNO：15所示。3.含有权利要求1所述的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：其为原核表达载体或者真核表达载体。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：原核表达载体为大肠杆菌表达载体pET-28a(+)。6.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：真核表达载体为毕赤酵母表达载体pPIC9。7.由权利要求5或6所述的表达载体所转化得到的重组菌株。8.一种利用权利要求7所述重组菌株制备绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括如下步骤：设计引物扩增上述绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因；构建含有上述绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的表达质粒；培养用该质粒所转化的宿主细胞，经过筛选得到菌株；培养菌株，诱导蛋白表达；分离并纯化所表达的蛋白。9.权利要求2所述的绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶蛋白在食品领域、造纸工业领域的应用。2CN102876692A说明书1/20页绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及绿盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因、含有该基因的表达载体的构建、该基因在宿主细胞中的蛋白表达，分离纯化及酶活性分析。背景技术[0002]多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases,PG)属于果胶酶(pectolyticenzymeorpectinase)的一种，其在应用上，具有与果胶酶相似的特性。[0003]果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，其大致分为果胶水解酶、果胶裂解酶、果胶酯酶和原果胶酶等,其中果胶水解酶又可分为多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases,PG)、多聚半乳糖醛酸甲酯水解酶(polymethylgalacturonases,PMG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶等。[0004]随着对果胶及果胶酶研究的日益深入,其应用领域已逐渐拓宽.尽管如此,就果胶酶的高效、多功能特点而言,其应用尚有较大的发展空间。[0005]果胶是植物细胞壁的主要成分。果胶酶能分解果胶，因此凡是与裂解植物的产业，都可应用到果胶酶。具体如下：[0006]果胶酶的应用性研究：[0007]1.利用果胶酶降解植物细胞的细胞壁，可用于果蔬汁的生产,果酒的澄清等。[0008]2.在油料萃取方面,将果胶酶和纤维素酶、半纤维素酶结合使用,可破坏油料作物的细胞壁,便于油料的释放,从而提高萃取率、提高油料的稳定性。[0009]3.中药药材处理方面，可利用果胶酶生产的提取物有：银杏叶提取物、大蒜油浓缩液、蘑菇浓缩液、人参浆、当归浸膏、甘草液等。另外,在金耳多糖、香菇多糖、金针菇多糖、山楂叶总黄