一种人角膜基质细胞系的构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102703375A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102703375A(43)申请公布日2012.10.03(21)申请号201210163244.2(22)申请日2012.05.24(71)申请人中国海洋大学地址266100山东省青岛市崂山区松岭路238号申请人青岛中皓生物工程限公司(72)发明人樊廷俊徐晓辉赵君苗莹王宝泉杜玉堂(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人张中南曾庆国(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书55页页(54)发明名称一种人角膜基质细胞系的构建方法(57)摘要一种人角膜基质细胞系的构建方法，具体涉及一种利用海水鱼类胶原蛋白制备组织工程人角膜基质载体支架的方法，是采用非酶解鳕鱼皮胶原蛋白冻干粉充分溶解于盐酸中，离心去除沉淀后将上清液分装入培养板孔中冻干，加入含硫酸软骨素的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联剂进行交联，用碱性Na2HPO4溶液稳定后，用2MNaCl、1MNaCl和蒸馏水清洗，冻干后完成制备。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可用于批量生产，满足组织工程人工角膜基质规模化重建对载体支架的大量需求，为人角膜基质病盲通过临床角膜移植和重见光明创造条件，且此载体支架制备以及应用于组织工程人工角膜基质体外重建和临床治疗的成本低。CN102735ACN102703375A权利要求书1/1页1.一种人角膜基质细胞系的构建方法，其特征在于所述的构建方法是先将角膜取出后用庆大霉素消毒，再撕除带有后弹力层的角膜内皮和带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜基质组织块后进行消化处理，将角膜基质组织块按近后弹力层面向下平贴于培养孔的底部，然后先加入无血清培养液在二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养，后将培养液更换为人角膜基质细胞专用培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，培养至第60代完成了人角膜基质细胞系的构建；其中，人角膜基质细胞专用培养液为含有20%胎牛血清、0.4‰~1.0‰羧甲基壳寡糖和0.01‰~0.02‰人碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于上述的培养液中还添加有0.1‰~0.2‰的I型胶原蛋白和0.05‰~0.1‰的II型胶原蛋白。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于上述的培养液中还添加有0.01‰~0.02‰的人基质细胞衍生因子1。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于上述的贴壁培养是先将贴有人角膜基质组织块的培养孔中加入0.1~0.3毫升的无血清DMEM/F12培养液，在二氧化碳培养箱中37℃下进行贴板培养12-16小时后，再将每个培养孔中的无血清培养液更换为1毫升人角膜基质细胞专用培养液。2CN102703375A说明书1/5页一种人角膜基质细胞系的构建方法技术领域[0001]本发明属于角膜细胞培养技术领域，具体涉及一种人角膜基质细胞系的构建方法。背景技术[0002]人角膜基质层（cornealstroma）由人角膜基质细胞和胶原纤维构成，厚约50-60微米，约占整个角膜厚度的90％，胶原纤维形成200-250个板层，各板层之间相互平行重叠并具有一定的曲率半径，且与角膜表面平行，保证了角膜的透明性。目前研究显示,临床上很多严重的角膜疾病如深度热烧伤、机械或手术创伤和化学灼伤以及多种病原微生物感染等，均可引起人角膜基质细胞受损，通常会导致角膜水肿和瘢痕形成从而使视力受损，严重者将导致角膜不透明，即引发角膜基质病盲疾病。角膜移植手术是目前角膜基质病盲患者得以治愈的唯一有效手段，但由于捐献的角膜数量极其有限，绝大部分角膜基质病盲患者得不到可用的捐献角膜而无法复明。近一个世纪以来，角膜组织工程技术的快速发展，使组织工程人角膜基质的体外重建及其作为捐献角膜的等效替代物用于临床角膜移植成为可能，也为角膜基质病盲患者通过移植组织工程人角膜基质重见光明创造了条件。但如何在体外获得形态结构和功能正常的大量人角膜基质细胞，一直是组织工程人角膜基质体外重建研究领域的热点和主攻方向。[0003]对人角膜基质细胞的体外培养研究开始于20世纪70年代，StoesserTR等首次对人角膜基质细胞进行了体外培养。随后，学者们先后对人角膜基质细胞的培养液和体外培养条件进行了研究，发现一些生长因子（BorderieV等，1998）、胎盘聚脱氧核苷酸（MuratoreO等，2003）、肝素（DenkPOandKnorrM，1999）等对角膜基质细胞具有一定的促分裂作用，但离细胞系的建立还相距甚远。20世纪90年代，许多学者纷纷利用人乳突淋瘤病毒（PetersDM等，1996）、端粒酶（