绿盲蝽几丁质合成酶1（CHS‑1）基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106222184A(43)申请公布日2016.12.14(21)申请号201610796741.4(22)申请日2016.08.31(71)申请人中国农业科学院植物保护研究所地址100193北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人王桂荣阿布都如苏力·吐孙刘扬(74)专利代理机构北京兆君联合知识产权代理事务所(普通合伙)11333代理人胡敬红(51)Int.Cl.C12N15/54(2006.01)A01N57/16(2006.01)A01P7/04(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页(54)发明名称绿盲蝽几丁质合成酶1（CHS-1）基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用(57)摘要本发明公开了一种绿盲蝽几丁质合成酶1(CHS-1)基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用。绿盲蝽ApCHS-1基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。通过dsRNA饲喂方法传递到体内，绿色荧光蛋白(GFP)和未加dsRNA作为对照组，统计饲喂后7天的死亡率，结果实验组7天后死亡率达到将近30％，同时有明显的蜕皮困难的异常表型，后续实时荧光定量PCR结果也证实了靶标基因明显的被沉默。本发明为将来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了效果较好的候选基因，同时本发明为将来的田间试验应用提供理论依据。CN106222184ACN106222184A权利要求书1/1页1.绿盲蝽ApCHS-1基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的绿盲蝽ApCHS-1基因在RNAi介导的害虫防治方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述RNAi介导中，合成的dsRNA通过注射或饲喂进入绿盲蝽体内。4.根据权利要求3所述的应用，所述合成dsRNA所对应的靶标片段的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。5.根据权利要求3所述的应用，所述注射体积为41.6nl，注射dsRNA浓度为10μg/μl，注射部位为绿盲蝽的后胸与腹部节间膜的最外侧。6.根据权利要求3所述的应用，所述饲喂的饲料总体积200ul，dsRNA浓度0.5ug/ul。7.根据权利要求3所述的应用，所述绿盲蝽为三龄绿盲蝽。2CN106222184A说明书1/8页绿盲蝽几丁质合成酶1(CHS-1)基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用技术领域[0001]本发明涉及昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种绿盲蝽几丁质合成酶1(CHS-1)基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用。背景技术[0002]过去很长一段时间棉铃虫是我国棉花生产的主要害虫，其防治由于化学防治为主的高压力状态而对其他一些次要害虫数量控制起到了抑制作用，危害也不那么严重。然而自1997年起Bt转基因棉花在我国大面积种植以来，虽然转基因Bt棉花有效控制了以前棉花头号敌人的棉Helicoverpaarmigera(Hubner)。然而农药喷施量的减少导致了处于次要地位的绿盲蝽Apolyguslucorum(Meyer-Dur)慢慢成为棉田主要害虫。当下绿盲蝽的防治主要以化学防治为主但农药的大量使用不但严重污染环境，而且害虫很容易对农药产生抗药性。所以发展一种环境友好型，经济效果好的新型防治策略是放在广大研究人员面前的迫在眉切的任务。[0003]RNAi发现为实现这个目标开辟了一道新路。当长的dsRNA进入细胞以后被称为Dicer的RNA酶III切割成20–25碱基长的小干扰(siRNA)，随后这些siRNA与一种Argonaute蛋白组装成RNAi诱导沉默复合体(RISC)，其与引导连互补的细胞内源性mRNA识别并降解而阻断基因翻译。[0004]在自然界几丁质是仅次于纤维素的大量存在的天然物质。几丁质是昆虫表皮和中肠围食膜的主要组成部分。一般情况下几丁质占昆虫干重的40％左右，这也可以看出几丁质的合成对昆虫来说何等重要。在昆虫体内大多数几丁质的合成是通过关键几丁质合成酶-1(CHS-1)的参与下完成的，所以在害虫防治角度来看CHS-1是一种重要的靶标基因。至今昆虫中有很多RNAi介导的CHS-1功能和致死的研究。比如赤拟谷盗CHS-1基因被RNAi沉默后出现畸形幼虫，蛹和成虫，幼虫中的几丁质含量降低了66.9％。甜菜夜蛾的CHS-1的RNAi实验结果表明靶标基因沉默后昆虫体内出现了蜕皮障碍、昆虫的生长发育受到抑制、气管发育畸形等表型。虽然在其他昆虫中已有上面所提的成功研究报告，然而至今还没有关于绿盲蝽CHS-1的任何研究报告。发明内容[0005]本发明的目的提供一种绿盲蝽几丁质合成酶-1基因(ApCHS-1基因)，在绿盲蝽生长发育和生理过程中起着非常重要的作用，沉默该基因后，对绿盲蝽个体发育