绿盲蝽V‑ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106350529A(43)申请公布日2017.01.25(21)申请号201610792416.0(22)申请日2016.08.31(71)申请人中国农业科学院植物保护研究所地址100193北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人王桂荣阿布都如苏力·吐孙刘扬(74)专利代理机构北京兆君联合知识产权代理事务所(普通合伙)11333代理人胡敬红(51)Int.Cl.C12N15/55(2006.01)A01N57/16(2006.01)A01P7/04(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表4页附图4页(54)发明名称绿盲蝽V-ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用(57)摘要本发明公开了绿盲蝽V-ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用。绿盲蝽V-ATPaseE基因序列如SEQIDNO：1所示。在该基因不同位置合成三个不同片段的dsRNA，并分别命名为dsVA-EF1，dsVA-EF2，dsVA-EF3，然后将所合成的dsRNA通过显微注射方法传递绿盲蝽三龄幼虫。统计注射后7天的存活率分别是55％，70％，68％。同时实时荧光定量PCR结果也证实了靶标基因明显的被沉默。然后选择VA-EF1dsRNA进行饲喂RNAi实验。结果7天后的存活率为65％。本发明为将来绿盲蝽RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了效果较好的候选基因并验证。CN106350529ACN106350529A权利要求书1/1页1.绿盲蝽V-ATPaseE基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的绿盲蝽V-ATPaseE基因在RNAi介导的害虫防治方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述RNAi介导中，合成的dsRNA通过注射或饲喂进入绿盲蝽体内。4.根据权利要求3所述的应用，所述合成的dsRNA所对应的靶标片断的核苷酸序列如SEQIDNO：2、SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示。5.根据权利要求4所述的应用，所述合成的dsRNA所对应的靶标片断的核苷酸序列如SEQIDNO：2。6.根据权利要求2所述的应用，所述注射体积为41.6nl，注射dsRNA浓度为10μg/μl，注射部位为绿盲蝽的后胸与腹部节间膜的最外侧。7.根据权利要求2所述的应用，所述饲喂的饲料总体积200ul，dsRNA浓度0.5ug/ul。8.根据权利要求2所述的应用，所述绿盲蝽为三龄绿盲蝽。2CN106350529A说明书1/9页绿盲蝽V-ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方面的应用技术领域[0001]本发明涉及昆虫基因工程技术领域，具体涉及一种绿盲蝽V-ATPaseE基因及其在RNAi介导的害虫防治方法的应用。背景技术[0002]在过去十几年，Bt转基因棉花在中国北方各省种植面积已达90％以上，转基因Bt棉花的大面积种植有效控制了以前棉花头号敌人的棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hubner)，使得用于棉田的农药量大量减少而获得了明显的经济效果和害虫防治效果。然而农药喷施量的减少导致处于次要地位的害虫绿盲蝽Apolyguslucorum(Meyer-Dur)越来越猖獗。每年长江和黄河流域因绿盲蝽所产生的经济损失对农业生产产生了很大的影响。至今绿盲蝽的防治由于缺乏有效的Bt蛋白，而主要依靠传统的化学防治，农药使用量的增多严重污染了环境。因此，发展一种环境友好，经济效益高的新的害虫防治策略是时代趋势。[0003]双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默通常被称为RNA干扰(RNAi)，当外源双链dsRNA(长双链RNA)或siRNA(小干扰RNA)被转入到细胞或组织时在体内产生内源靶标互补mRNA的序列的特异性降解并阻断转录，抑制翻译的现象。在这个过程中首先dsRNA被Dicer酶切割成21-23bp长度的小分子RNA即siRNA，然后RNA在诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的作用下siRNA被解旋成单链，反义链特异性地与同源mRNA(靶标)结合并引导RISC使mRNA发生断裂而导致基因表达沉默。RNAi的发现在生物领域彻底改变了研究方法和思考模式。通过将近20年的研究实际RNAi已变成了非常成熟的反向遗传学研究基因功能的巧妙工具。至今RNAi在医学，作物改良，农业，畜牧业，园艺，农业等方面取得了很大的进展。理论上讲我们通过RNAi也可沉默任何一个对我们不利基因。至今研究人员在这些方面做了大量研究筛选出大量的靶标基因，并实际应用取得了令人兴奋地突破。比如Baum等(Baum,J.A.etal.(2007)Controlofcoleopteraninsect