云南杜鹃高效再生体系的建立方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102919125A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102919125A(43)申请公布日2013.02.13(21)申请号201210450106.2(22)申请日2012.11.13(71)申请人云南省农业科学院花卉研究所地址650205云南省昆明市龙头街桃园村(72)发明人彭绿春解玮佳张艺萍瞿素萍李世峰苏艳宋杰(74)专利代理机构昆明合众智信知识产权事务所53113代理人康珉(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书权利要求书2页2页说明书说明书77页页附图附图55页(54)发明名称云南杜鹃高效再生体系的建立方法(57)摘要本发明为一种云南杜鹃高效再生体系的建立方法，属于植物生物技术育种领域。该方法以云南杜鹃无菌苗的中上部叶片为材料，在WPM培养基的基础上，主要配有激素TDZ、ZT、2,4-D、NAA、IAA、水解酪蛋白中一种或几种及适宜的浓度，通过叶片直接再生和间接再生两条途径获得完整植株。本发明首次对云南杜鹃建立了高效再生体系，为云南杜鹃的基因工程育种工作提供了良好的理论基础和实验依据，同时将有效推动杜鹃花生物技术育种进程。CN10295ACN102919125A权利要求书1/2页1.云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：（1）无菌苗的获得取侧芽饱满的云南杜鹃半木质化茎段，剪成带有1～2个侧芽的茎段，用洗衣粉水清洗之后，清水漂洗干净，在无菌条件下依次用质量分数为0.12%的升汞溶液浸泡15min，质量分数为2%的次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗3～5次，切去茎段两头接种于诱导培养基上诱导侧芽萌发，待不定芽长至2～3cm时切下不定芽转入增殖培养基上培养获得无菌苗，所述的诱导培养基为：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L，pH值为5.4；所述的增殖培养基为：WPM+ZT2mg/L，pH值为5.4；（2）再生体系的建立①叶片直接再生不定芽将步骤（1）中获得的28～32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成0.5cm2～0.8cm2的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于叶盘分化培养基A中或叶盘分化培养基B中，叶盘分化培养基A为：WPM+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4，叶盘分化培养基B为：WPM+ZT2～4mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；或②叶片间接再生不定芽A.将步骤（1）中获得的28～32天苗龄无菌苗的中上部叶片，切成约0.5cm2～0.8cm2的叶盘，并在叶盘背面划伤口，叶盘背面朝下接种于愈伤组织诱导培养基中培养，所述的愈伤组织诱导培养基为：WPM+TDZ0～0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L+水解酪蛋白0～500mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；B.将步骤（2）②A中得到的愈伤组织转接入愈伤组织分化培养基中诱导不定芽，所述的愈伤组织分化培养基为：WPM+ZT4.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；（3）壮苗培养将步骤（2）①叶片直接再生不定芽培养出的不定芽或将（2）②叶片间接再生不定芽培养出的不定芽分棵切开或切成3-5棵为一丛放入壮苗培养基中培养20～25天，所述的壮苗培养基为：WPM+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；（4）生根培养将经步骤（3）壮苗培养的苗分棵切开，接种于生根培养基中培养，所述的生根培养基为：1/2WPM+IAA1.0～1.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4；以上各步骤培养条件均为：温度为23℃士2℃，光照强度为2000lx，光照时间12h·d-1，各培养基中蔗糖和琼脂含量的百分数为质量百分数。2.根据权利要求1所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于：步骤（2）①所述的叶盘分化培养基B为：WPM+ZT4mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4。3.根据权利要求1或2所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于：步骤（2）②A所述的愈伤组织诱导培养基为：WPM+TDZ0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4。4.根据权利要求1或2所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于：步骤（4）所述的生根培养为：1/2WPM+IAA1.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4。2CN102919125A权利要求书2/2页5.根据权利要求3所述的云南杜鹃高效再生体系的建立方法，其特征在于：步骤（4）所述的生根培养为：1/2WPM+IAA1.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH值为5.4。3CN10291