红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113403307A(43)申请公布日2021.09.17(21)申请号202010565848.4C12N15/10(2006.01)(22)申请日2020.06.19C12R1/19(2006.01)C12R1/01(2006.01)(71)申请人浙江万里学院地址315100浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号(72)发明人贾永红吴月燕(74)专利代理机构宁波甬致专利代理有限公司33228代理人李迎春(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)C12N15/84(2006.01)C12N1/21(2006.01)A01H5/02(2018.01)A01H6/36(2018.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用(57)摘要本发明从红比利时杜鹃(Rhododendronhybridum)花瓣组织中获得一个具有较高启动活性的启动子。该启动子全长1477bp，能高效启动查尔酮合成酶(Chalconesynthase，CHS)基因的表达，本发明的启动子可借助基因重组技术置换其他物种中低表达水平的CHS基因的启动子，提高CHS酶活，加大花色苷代谢通路下游途径中花青素和花青苷的合成，从而影响花瓣的颜色表现，本发明在促进包括杜鹃花在内的诸多园艺花卉育种研究中具有重要作用，具有良好的经济价值和社会价值。CN113403307ACN113403307A权利要求书1/1页1.一种红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子，其特征在于，其序列为：(1)如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；(2)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列中发生一处或多处点突变，但依然具备RhCHS基因启动子功能的核苷酸序列。2.一个重组载体，由权利要求1所述的启动子与pCAMBIE1301质粒经基因重组技术构建。3.一个用于启动子扩增的重组细胞，由权利要求2所述的重组载体与大肠杆菌感受态DH5α制备而成。4.一个用于瞬时转化的重组细胞，由权利要求2所述的重组载体与根农杆菌GV3101制备而成。5.一种用于制备权利要求1所述红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子的方法，其特征在于，包含以下步骤：以红比利时杜鹃花瓣DNA为模板，使用3条特异性引物扩增而得到，所述3条特异性引物的序列如SEQIDNO2、NO3、NO4所示。6.权利要求1所述红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子在园艺植物花色育种研究与实践中的应用。2CN113403307A说明书1/5页红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一个来源于红比利时杜鹃花瓣组织中的查尔酮合成酶(Chalconesynthase，CHS)基因启动子的获得及其在花色育种研究中的应用。背景技术[0002]启动子是位于结构基因5'端上游区的一段DNA序列，长度在1000-2000bp不等。该段DNA序列能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并开启转录。基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效形成二元复合物，启动子的序列会影响其与RNA聚合酶的亲和力，从而影响基因表达水平。在启动子核心区域的转录起始位点附近通常含有序列为TATAAA的TATAbox结构；在转录起始位点5’端上游通常含有序列为CCAAT的CAATbox和序列为GGCGGG的GCbox结构，这些结构能干扰启动子活性表现，决定转录特异性和活性。因此，克隆、分析并验证启动子的序列、顺式作用元件组成和功能表现，不但能提高功能基因时空表达规律的认识，而且能针对性控制外源刺激因子以调控功能基因表达效果都具有重要作用。[0003]杜鹃花，位居中国十大名花座次之六，享“繁花似锦”之美誉。该花以枝繁叶茂、花色艳丽而蜚声中外，具较高观赏价值和商业价值。红比利时杜鹃作为重要的观赏杜鹃之一，有红、白、粉、淡绿、嵌色系等许多类型，也是世界盆栽花卉生产的主要种类之一。作为苯丙氨酸代谢途径(generalphenylpropanoidpathway)的限速酶，CHS对花色苷前体物合成的结果具有重要影响。作为调控CHS基因表达效率的启动子，能够影响CHS酶的表达产量，最终也会影响植物花瓣花色的表现。[0004]本发明对红比利时杜鹃花瓣组织中的CHS基因的上游启动子进行研究，并对获得的序列做顺式作用元件分析。通过重组技术构建包含本启动子的重组载体并注射烟草叶片组织，借助GUS组织染色方法观察染色效果，从而确定该启动子的活性。发明内容[0005]本发明所要解决的技术问题是：提供一种红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子以解决目前红比利时杜鹃花瓣组织中CHS基因启动子研究不足的问题，并提供该启