具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖、提取分离方法和在制备抗肿瘤药物的补充剂中的应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114989323A(43)申请公布日2022.09.02(21)申请号202210696024.X(22)申请日2022.06.20(71)申请人天津科技大学地址300457天津市滨海新区经济技术开发区第十三大街9号(72)发明人刘会平闫芝茜刘易坤(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司12209专利代理师韩晓梅(51)Int.Cl.C08B37/00(2006.01)A61K31/715(2006.01)A61P1/16(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图7页(54)发明名称具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖、提取分离方法和在制备抗肿瘤药物的补充剂中的应用(57)摘要本发明属于功能性食品领域，提供一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖的制备及结构表征方法。本发明通过水提醇沉法制备杜仲叶多糖，采用凝胶色谱柱进行分离纯化，得到均一性的杜仲叶多糖(EFP)。采用高效液相色谱、离子色谱、红外光谱和NMR对其进行表征。在小鼠体内研究了EFP这一组分的免疫调节和抗肿瘤作用，证明EFP的抗肿瘤活性较高，有望作为一种潜在的抗肿瘤药物进行开发。CN114989323ACN114989323A权利要求书1/2页1.一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖，其特征在于：所述杜仲叶多糖的相对分子量为9.98×105Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸按摩尔比为：0.226:1.739:2.183:1:0.155:0.321:0.358:0.047组成。2.根据权利要求1所述的杜仲叶多糖，其特征在于：所述杜仲叶多糖是一种同时含有α‑型糖苷键和β‑型糖苷键的酸性多糖，其主链由α‑L‑Araf‑(1→、→3,5)‑α‑Araf‑(1→、→3)‑β‑Galp‑(1→、→3,6)‑β‑Glcp‑(1→、→2)‑α‑D‑Manp‑(1→、→4)‑α‑GalpA‑(1→和→2,4)‑α‑Rhap‑(1→组成；或者，所述杜仲叶多糖是一种同时含有α‑型糖苷键和β‑型糖苷键的酸性多糖，红外光谱中1617.03cm‑1处出现的吸收峰和13CNMR中173.30ppm处的低场信号都证明了糖醛酸的存在。3.根据权利要求1或2所述的杜仲叶多糖，其特征在于：所述杜仲叶多糖在建立的H22荷瘤小鼠模型中能够诱导肿瘤细胞的凋亡，将其DNA复制周期阻滞在S期，同时降低肿瘤细胞线粒体膜电位，以此来抑制肿瘤的生长。4.如权利要求1至3任一项所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤如下：(1)干燥的杜仲叶粉末作为原料，蒸馏水作为提取剂，采用水提醇沉法对杜仲叶粗多糖进行提取；(2)采用葡聚糖凝胶柱SephadexG‑200对杜仲叶多糖进行分离纯化，得到均一杜仲叶多糖EFP。5.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：提取的具体方法为提取温度100℃，料液比为1:20，提取时间为3小时，提取次数3次，醇沉浓度为60％。6.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：分离纯化的具体方法为采用SephadexG‑200凝胶柱进行洗脱，洗脱速度为0.1mL/min，每一管的收集时间设定为25min。7.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：干燥是指在50℃的烘箱中干燥3小时，再过60目筛；或者，步骤(1)中采用5g杜仲叶粉末采用250mL石油醚，在水浴70℃的条件下进行脱脂处理，冷凝回流6小时后进行烘干处理，得到脱脂的杜仲叶粉末；或者，步骤(1)中杜仲叶粉末和水的比例为1:20，提取时间为3小时，提取次数为3次，醇沉浓度为60％；或者，步骤(1)中提取液被浓缩至三分之一体积，得到浓缩液；或者，步骤(1)中浓缩液中加入乙醇过夜后，通过在4000rpm下离心10min获得粗多糖。8.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(2)包括向杜仲叶粗多糖溶液中加入1/5倍体积的Sevage试剂，Sevage试剂由正丁醇和三氯甲烷以4:1的比例配置得到，充分震荡20min后静置，等待溶液分层，弃去蛋白层，多糖溶液和Sevage试剂进行回收，再补充少量的Sevage试剂。重复5‑7次直到多糖溶液中不再看到蛋白层出现，剩余的有机试剂通过旋转蒸发仪除去；或者，步骤(2)包括除去蛋白后的粗多糖溶液用蒸馏水在4℃透析(100kDa)3天，期间每隔8小时换一次水，冷冻干燥并收集得到粗杜仲叶多糖(cEFP)；或者，步骤(2)中精准称量20mg样品cEFP溶于1mL蒸馏水中，通过0.45μm滤膜。采用2CN114989323A权利要求书2/2页SephadexG‑200凝胶柱进行洗脱，准确控制0.1mL/min为洗脱