具有抗补体活性的杜仲叶多糖及其提取与分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102225969A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102225969A(43)申请公布日2011.10.26(21)申请号201110085662.X(22)申请日2011.04.07(71)申请人贵州大学地址550003贵州省贵阳市贵州大学蔡家关校区化学与化工学院(72)发明人张学俊宫本红龚桂珍(74)专利代理机构贵阳中工知识产权代理事务所52106代理人刘安宁(51)Int.Cl.C08B37/00(2006.01)A61P29/00(2006.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称具有抗补体活性的杜仲叶多糖及其提取与分离纯化方法(57)摘要本发明公开了具有抗补体活性的杜仲叶多糖及其提取与分离纯化方法，具有抗补体活性的杜仲叶多糖是酸性多糖。提取方法是将干杜仲碎片加入石油醚，回流并磁力搅拌处理，抽滤；滤渣风干后用热水沸腾回流提取，纱布挤滤除渣；并提取液，减压浓缩；将多糖浓缩液与无水乙醇混合，静止沉淀，离心得醇沉多糖。分离纯化方法是将粗多糖组分配置成多糖溶液，抽滤，用大孔树脂脱色；用Sevag法脱蛋白，用Sevag试剂与多糖样品混匀，离心分离，收集上清液并浓缩，紫外扫描，直至无吸收峰为止；分别将粗多糖溶液透析；然后称取多糖溶于蒸馏水中，上纤维素柱洗脱，得到精多糖的单体组分。本法实现了杜仲叶资源的开发，为将其应用于制药工业打下基础，为人类的健康服务。CN102596ACCNN110222596902225976A权利要求书1/2页1.具有抗补体活性的杜仲叶多糖，其特征在于该多糖是酸性多糖，其中活性最高的组成为：L-鼠李糖、D-岩藻糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡糖糖、D-半乳糖和糖醛酸，它们的质量分数分别是：11.8％，1.6％，37.7％，4.2％，10.7％，12.8％，21.2％。2.如权利要求1所述的杜仲叶多糖的提取方法，其特征在于该方法是将干杜仲叶粉碎成＜5mm左右的碎团以破坏杜仲胶丝，加入石油醚，80℃下回流并磁力搅拌处理2h，以去除表面脂肪及杜仲胶；重复一次，取滤渣，抽滤；风干后，用热水提取，加水没过原料，沸腾回流提取2h，提取3次，三层纱布挤滤除渣；并提取液，减压浓缩到比重为1.1～1.2；将多糖浓缩液与等量无水乙醇混合，静止沉淀，离心得1倍体积醇沉多糖PsEUL1；分离上清液，并再加入一倍体积乙醇，混匀静止，得到2倍体积醇沉多糖PsEUL2；离心分离沉淀后，再于上清液中加入一倍体积乙醇，得到3倍体积醇沉多糖PsEUL3。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述杜仲叶多糖在测定质量后，用硫酸苯酚法分别测其纯度；用考马斯亮蓝法分别测其蛋白质含量。4.如权利要求1所述的杜仲叶多糖的分离纯化方法，其特征在于该方法是：分别将粗多糖组分PsEUL1、PsEUL2、PsEUL3配置成2％的多糖溶液，抽滤除去不溶沉淀，用S-8大孔树脂脱色；采用Sevag法脱蛋白，将氯仿∶正丁醇＝5∶1的Sevag试剂与多糖样品1∶1混匀，以4000r/min转速离心10min，收集上清液并浓缩，重复除蛋白操作8～10次至中间层无沉淀，于190～400nm进行紫外扫描，直至无吸收峰为止；分别将粗多糖溶液采用截留分子量为14000的透析袋透析，直到用电导仪测得的多糖电导率趋于零，且没有变化为止；然后称取0.2g杜仲叶多糖PsEUL1，溶于3mL蒸馏水中，上2.5cm×25cm的DEAE-52(OH)纤维素柱，分别用清水→1mol/LNaCl溶液洗脱，控制流速1mL/min，自动部分收集器收集，每10mL一管，以硫酸-苯酚法隔管跟踪监测，收集同一峰含多糖各管样品，以管号为横坐标，多糖溶液吸光度为纵坐标，作洗脱曲线；得到精多糖的单体组分。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述精多糖单体组分通过经典途径或替代途径进行抗补体活性测定。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述经典途径测定抗补体活性的方法是：取100μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH7.0～7.5样品液加入试管；再加入100μL以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1∶100稀释的正常豚鼠血清和100μL致敏即5×108个/mL的绵羊红细胞，轻轻混匀；37℃水浴孵育30min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1ml冷生理盐水终止反应；于2000r/min转速下离心10min，取上清液在波长405nm处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计：7.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述替代途径测定抗补体活性的方法是：取100μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH7.0～7.5的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA的2倍缓冲液，按1∶2稀释的正常豚鼠血清和100μL即1.5×108个/mL的兔红细胞悬液，轻轻混匀；37