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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115725637A(43)申请公布日2023.03.03(21)申请号202211253416.5(22)申请日2022.10.13(71)申请人贵州省农业科学院地址550006贵州省贵阳市小河区金农社区金农路1号申请人贵州大学(72)发明人赵德刚谢宇峰秦利军(74)专利代理机构北京兆君联合知识产权代理事务所(普通合伙)11333专利代理师胡敬红(51)Int.Cl.C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)C12P5/00(2006.01)C12R1/865(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表(电子公布)附图3页(54)发明名称一种利用重组酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法(57)摘要本发明公开一种利用重组酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法。该方法的主要步骤包括:建含有里氏木霉(Trichodermareesei)纤维素酶基因Cel5A/Cel6A的表达载体,导入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)构建工程酵母菌,并利用工程酵母对超声预处理后的杜仲叶片进一步酶解以实现对杜仲胶的完全释放,对发酵产物利用索氏提取纯化杜仲胶,实现对杜仲胶的充分提取。本发明方法无需高浓度碱液酸液裂解、多次反复冲洗,避免了橡胶在提取过程中形态结的破坏,减少了提取过程中有害废液的产生,对实现杜仲胶的绿色提取具有指导意义。CN115725637ACN115725637A权利要求书1/2页1.重组表述载体,其特征在于:以pAUR101为基础载体,将乙醇脱氢酶(ethanoldehydrogenase,ADH)基因启动子序列(PADH1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)基因终止子序列连接到表达载体pAUR101上,得到中间表达载体pAUR101‑PADH1,再将里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶Cel5A基因或里氏木霉(T.reesei)外切葡聚糖酶Cel6A基因分别连接到中间载体上得到重组表述载体,所述Cel5A基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述Cel6A基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的重组表达载体,命名为pAUR101‑PADH1::Cel5A或pAUR101‑PADH1::Cel6A,其结构如图2或图3所示。3.重组酿酒酵母工程菌,含有权利要求2所述的重组表达载体pAUR101‑PADH1::Cel5A或pAUR101‑PADH1::Cel6A。4.根据权利要求3所述的工程菌,所述的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株为INVSc1#,具有氨苄和卡纳抗性。5.一种利用重组酿酒酵母发酵杜仲叶制取杜仲胶方法,采用如下顺序步骤:1)杜仲叶发酵预处理:将自然风干的杜仲叶片破碎至2‑4mm的组织碎屑,加入0.1g/LSDS,50%乙醇,超声处理;之后煮沸除去叶绿素,过滤后备用;2)杜仲叶发酵工艺:活化权利要求3或4中含有Cel5A基因和Cel6A基因的两种重组酿酒酵母工程菌,添加预处理过的杜仲叶,进行发酵,发酵工艺条件为料液比1:10,发酵30℃,pH7,发酵120h;3)提取杜仲胶:取出发酵固形物,过滤、自然风干后以石油醚为溶剂,加热回流,然后将溶液冷却析出沉淀,沉淀自然风干即为杜仲胶。6.根据权利要求5所述的方法,其中两种重组酿酒酵母工程菌的体积比为1:1。7.根据权利要求5所述的方法,所述活化为重组酿酒酵母工程菌按接种比1:100接种于5L马铃薯葡萄糖液体培养基(PotatoDextrose,PD)中并发酵,所述重组酿酒酵母工程菌的制备方法,将权利要求2中表达载体pAUR101‑PADH1::Cel5A或pAUR101‑PADH1::Cel6A经酶切验证后导入大肠杆菌(E.coliDH5α);然后利用StuI酶切线性化,经胶回收纯化后热激法对受体酿酒酵母菌进行转化,热激条件为:42℃,热击30min。8.根据权利要求7所述的方法,所述表达载体pAUR101‑PADH1::Cel5A或pAUR101‑PADH1::Cel6A的构建方法为:以pAUR101为基础载体,将乙醇脱氢酶(ethanoldehydrogenase,ADH)基因启动子序列(PADH1)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)基因终止子序列连接到表达载体pAUR101上,构建中间表达载体pAUR101‑PADH1,再将里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶Cel5A基因或里氏木霉(T.reesei)外切葡聚糖酶Cel6A基因连接到中间载体上而得到,所述Cel5A基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示,所述Cel6A基因的核苷酸序列如SEQI