利用动态代谢控制从木糖生产木糖醇的方法和组合物.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115916990A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202180037240.7(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限(22)申请日2021.04.02公司11002专利代理师林玉妹赵赫(30)优先权数据63/004,7402020.04.03US(51)Int.Cl.C12P7/18(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日2022.11.22(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2021/0254872021.04.02(87)PCT国际申请的公布数据WO2021/242408EN2021.12.02(71)申请人杜克大学地址美国北卡罗来纳州(72)发明人迈克尔·D·林奇李帅权利要求书3页说明书39页序列表11页附图20页(54)发明名称利用动态代谢控制从木糖生产木糖醇的方法和组合物(57)摘要本发明涉及用于木糖醇生产的基因工程微生物菌株和相关生物工艺。特别地，使用动态控制的合成代谢阀来降低某些酶的活性，导致两阶段工艺中木糖醇产量的增加。CN115916990ACN115916990A权利要求书1/3页1.一种用于从木糖生产木糖醇的经遗传修饰的微生物，其包括：木糖还原酶表达的可诱导性修饰和可诱导性合成代谢阀，所述可诱导性合成代谢阀包括：沉默基因表达的合成代谢阀，其特征在于沉默编码一种或多种酶的一种或多种基因的基因表达；或酶促降解合成代谢阀，其特征在于诱导一种或多种酶的酶促降解，或它们的组合。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述木糖还原酶是NADPH依赖性木糖还原酶。3.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述木糖还原酶是黑曲霉(A.niger)的xyrA基因。4.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述经遗传修饰的微生物从木糖原料生产木糖醇。5.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制编码木糖异构酶的基因或木糖异构酶。6.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制编码葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)的基因或葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)。7.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制至少两个基因，包括编码葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)的基因或所述葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)；和编码木糖异构酶的基因或木糖异构酶。8.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制至少两个基因，包括编码葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)的基因或葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)；和编码烯脂酰‑ACP还原酶(fabI)的基因或烯脂酰‑ACP还原酶(fabI)。9.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀由以以下组成：沉默编码葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)的基因，和酶促降解葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(zwf)和烯脂酰‑ACP还原酶(fabI)。10.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中在多阶段生物发酵工艺的过渡阶段的条件下诱导木糖还原酶的表达、沉默基因表达的合成代谢阀和酶促降解合成代谢阀。11.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述诱导通过营养耗竭发生。12.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述诱导通过磷酸盐耗竭发生。13.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其进一步包含染色体缺失。14.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述基因表达的沉默包括CRISPR干扰，并且所述经遗传修饰的微生物还表达CASCADE向导阵列，所述阵列包括两个以上编码小向导RNA的基因，所述小向导RNA各自特异性地靶向不同的基因，以同时沉默多个基因。15.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物在生物发酵过程中在2CN115916990A权利要求书2/3页约24小时时产生大于20g/L的木糖醇产物滴度。16.一种多阶段发酵生物工艺，其用于由经遗传修饰的微生物生产木糖醇，其包括：(a)提供经遗传修饰的微生物，其包含：对木糖还原酶的表达的修饰和合成代谢阀，其包括：沉默基因表达的合成代谢阀，其特征在于沉默编码一种或多种酶的一种或多种基因的基因表达；或酶促降解合成代谢阀，其特征在于诱导一种或多种酶酶促降解，或它们的组合，其中所述每个合成代谢阀的一种或多种酶相同或不同；和(b)使所述经遗传修饰的微生物在含有木糖原料的培养基中生长；(c)通过以下方式从生长期过渡到木糖醇生产阶段诱导一个或多个所述合成代谢阀以使微生物的生长减缓或停止；和诱导木糖还原酶的表达