梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒及其制备.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102081096A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102081096A(43)申请公布日2011.06.01(21)申请号201110027404.6(22)申请日2011.01.25(71)申请人厦门大学附属中山医院地址361005福建省厦门市思明区湖滨南路201-209号(72)发明人张忠英刘莉莉林丽蓉杨天赐(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所35200代理人马应森(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)G01N33/571(2006.01)G01N33/558(2006.01)G01N33/532(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒及其制备(57)摘要梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒及其制备，涉及一种试剂盒。试剂盒设载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线、对照线，检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。先制备梅毒特异性重组抗原，再制备心磷脂抗原，然后硝酸纤维素膜的点样，制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在标记抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶后制备免疫印迹试剂盒。可用于全血、血清、血浆及脑脊液等标本中梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体的检测。CN102896ACCNN110208109602081101A权利要求书1/2页1.梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于设有载体板、硝酸纤维膜、梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线、对照线，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体；辣根过氧化物酶标记抗人γ链抗体。2.如权利要求1所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于所述梅毒特异性重组抗原为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原。3.如权利要求1所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒，其特征在于所述载体板采用PVC板。4.如权利要求1所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)制备梅毒特异性重组抗原采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒特异性重组抗原；2)制备心磷脂抗原猪心肌组织经低温速冻后风干，研磨成粉状后用甲醇和氯仿抽提，抽提液通过硅胶层析柱洗脱，提取纯度95％以上的心磷脂抗原；3)硝酸纤维素膜的点样在硝酸纤维素膜总抗体检测线上包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，晾干；4)制备抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体以人IgG特异性片段γ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得稳定分泌抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株；5)抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记采用过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；6)制备免疫印迹试剂盒将硝酸纤维膜粘贴在载体板上表面，梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体检测线处包被梅毒特异性重组抗原和心磷脂抗原，在对照线处包被人IgG抗体，用切条机切成条状，和酶标记的抗人IgG抗体及其底物共同组装成梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒。5.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)、3)、6)中，所述梅毒特异性重组抗原为TPN15、TPN17、TPN37、TPN44.5、TPN47梅毒特异性重组抗原。6.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述甲醇和氯仿，按体积比甲醇∶氯仿为2∶1；7.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述梅毒特异性重组抗原的浓度为1～4mg/mL；点样量为2CCNN110208109602081101A权利要求书2/2页1μL/cm，所述的心磷脂抗原的浓度为0.003％～0.03％，点样量为1μL/cm。8.如权利要求4所述的梅毒特异性IgG抗体和心磷脂IgG抗体免疫印迹试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤4)中