转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102690835A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102690835A(43)申请公布日2012.09.26(21)申请号201210173356.6C12Q1/68(2006.01)(22)申请日2012.05.30(71)申请人曹际娟地址116001辽宁省大连市中山区长江东路60号申请人徐君怡曹冬梅郑秋月(72)发明人曹际娟徐君怡曹冬梅郑秋月(74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司21212代理人贾汉生(51)Int.Cl.C12N15/63(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书1212页页序列表序列表33页页附图附图44页页(54)发明名称转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用(57)摘要本发明公开一种转基因大豆GTS40-3-2的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因大豆中的应用，以转基因大豆GTS40-3-2为原料，确定其品系特异性目标基因，即转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因和大豆内源Lectin基因，将两个目标DNA片段构建在载体pMD19-T上，并将阳性质粒用Hind-III酶进行线性化处理，最后按310pg/mL定量分装；通过上述方法获得转基因大豆GTS40-3-2的标准样品，也可以应用于转基因大豆Real-TimePCR检测试剂盒。这对深入研究转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，开展转基因产品检测标准样品的研制具有现实意义。CN10269835ACN102690835A权利要求书1/1页1.一种转基因大豆GTS40-3-2标准样品，其特征在于，其按照如下方法制备：①以转基因大豆GTS40-3-2的基因组为模板，分别以SEQIDNO：1、SEQIDNO：2和SEQIDNO：4、SEQIDNO：5为引物，PCR扩增，得到两个目的片段；PCR扩增条件：94℃预变性3.0min；94℃变性0.4min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃5min；②将步骤①扩增的两个目的片段通过人工合成连接在一起之后，再连入质粒载体pMD19-T中；并转化至JM109感受态细胞中，获得重组菌株；③将步骤②获得的重组菌株提取质粒，进行测序鉴定，鉴定结果以碱基序列中包含序列SEQIDNO：7的质粒所对应的重组菌株为阳性菌株；④大量提取步骤③所述阳性菌株的质粒，用Hind-III限制性内切酶进行线性化后分装，获得转基因大豆GTS40-3-2标准样品。2.一种转基因大豆GTS40-3-2的Real-TimePCR检测试剂盒，其特征在于，包括转基因大豆GTS40-3-2检测基因和阳性标准对照品，Ⅰ.转基因大豆GTS40-3-2检测基因，包括：GTS40-3-2品系特异性的引物和探针序列：正向引物：SEQIDNO：1反向引物：SEQIDNO：2探针：SEQIDNO：3大豆内源Lectin基因的引物和探针序列：正向引物：SEQIDNO：4反向引物：SEQIDNO：5探针：SEQIDNO：6Ⅱ.所述的阳性标准对照品是权利要求1所述的转基因大豆GTS40-3-2标准样品。2CN102690835A说明书1/12页转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用技术领域[0001]本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及转基因大豆GTS40-3-2的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因大豆GTS40-3-2中的应用。背景技术[0002]转基因大豆40-3-2(Roundupready)是Monsanto的产品。在7个转基因大豆品系中GTS40-3-2(RoundupReady)是目前最多用于食品和饲料的。该品系所改变的性状为耐除草剂（草甘膦）。在不同国家被批准食用的时间分别为：美国1994年；加拿大、阿根廷、日本、荷兰、瑞士1996年；乌拉圭1997年；巴西、墨西哥1998年；俄罗斯1999年；韩国、罗马尼亚2000年；南非2001年。可供人类食用或动物饲用。[0003]近年来，转基因作物培育技术取得突破进展，陆续推出了一批新品种，在改善农作物品质、提高产量等方面发挥了巨大作用。然而，人们对转基因食品的安全性问题存在着很多的争论。转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、作为食品对人体健康影响的问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界广泛性的关注。转基因产品的安全性问题已由学术观点分歧，发展到知识产权、环境问题、经济问题甚至政治问题。欧盟和一些国家相继出台了转基因产品管理法规，我国于2002年3月开始实施《农业转基因生物安全管理条例》及其三个配套管理办法。2001年，欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出对非转基因食品只要不是有意污染，允许含有1%的转基因产品（阈值），而不用标识。日本、韩