啤酒废酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CN104371000A(43)申请公布日(43)申请公布日2015.02.25(21)申请号201310361878.3(22)申请日2013.08.14(71)申请人梅乐和地址315100浙江省宁波市高教园区钱湖南路1号(72)发明人梅乐和(51)Int.Cl.C07K5/037(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07H21/02(2006.01)C07H1/08(2006.01)权利要求书2页说明书3页(54)发明名称啤酒废酵母中谷胱甘肽和核糖核酸的高效提取(57)摘要本发明提供了一种从啤酒废酵母中高效提取谷胱甘肽和核糖核酸的生产方法，其步骤包括：加入两性生物絮凝剂，对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附。将湿酵母进行酶辅助热破胞抽提，离心收集上清。将上清液采用截留孔径为10000道尔顿的陶瓷膜进行超滤，分子量大于10000为核酸和大分子杂蛋白，小于10000为谷胱甘肽和小分子杂质。将核糖核酸大分子蛋白经硅胶柱吸附，95％乙醇洗柱，60℃无菌水洗脱，干燥得高纯度核酸。谷胱甘肽小分子杂质经纳滤，扩张床亲和层析，浓缩，乙醇沉淀干燥后得谷胱甘肽。本发明得到的产品具有纯度高、生物活性好，可循环利用废弃物，环保高效，同时降低了生产成本，适于大规模工业化生产。CN104371000ACN104371000A权利要求书1/2页1.一种啤酒废酵母高效提取技术制备谷胱甘肽和核糖核酸的制备方法，其特征包括以下几个步骤：(1)两性生物絮凝剂应用于啤酒废酵母脱苦、去杂处理废啤酒酵母泥加2倍以上冰水搅拌均匀，加入两性生物絮凝剂对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附，只需在破胞前对啤酒废酵母进行一次清洗，就能有效去除这些杂质。然后放置在冰箱中沉降絮凝，用鼓式过滤机连续过滤去杂后得湿酵母。(2)多酶复合、可靠酶解技术应用于啤酒废酵母酶辅助热破胞抽提通过采用酶工程技术对传统的蛋白酶进行了蛋白质工程改造，获得了具有更好的酶解性能的新型蛋白酶，并利用多酶复合、可控酶解技术，对啤酒废酵母进行酶辅助热破胞抽提，达到了蛋白质降解的最优化。热水抽提谷胱甘肽：湿酵母与废水按1∶15质量比混合，加热到90℃后，快速冷却到20℃以下，再用盐酸调整pH值至3.5后离心收集上清液。(3)膜分离技术应用于谷胱甘肽和核酸的相容性高效分离、纯化采用截留孔径为10000道尔顿的陶瓷膜对破胞液进行超滤，通过超滤将破胞液中相对分子量大于10000的物质与小于10000的物质进行分离。前者包括一些核酸和大的蛋白质杂质，后者包括谷胱甘肽和一些分子量较小的杂质。谷胱甘肽和核糖核酸属于两种完全不同的物质，在分子量、电荷等性质上存在较大差异。在已有的啤酒废酵母综合利用的研究和报道中，都未有同时提取谷胱甘肽和核糖核酸的先例。而本项目的这一步实现了谷胱甘肽和核糖核酸的分流，从而达到了对这两个物质的同时提取。因此在后续的分离纯化过程中，就不必再担心两种物质在提取方法上的不兼容性，只需分别关注各自的分离与纯化即可。(4)核糖核酸的分离纯化利用能专一性吸附核酸的硅胶树脂进行核糖核酸的吸附，实现对核糖核酸的高纯度、高收率提取，使核糖核酸的收率达到4％、纯度大于80％。硅胶柱吸附(高盐低pH值)，实现对核酸的专一性吸附，去除蛋白质杂质，然后用95％的乙醇洗柱。60℃无菌水洗脱核糖核酸，喷雾干燥，得高纯度核糖核酸。(5)谷胱甘肽的分离纯化采用截留孔径为100道尔顿的卷式膜进行纳滤，去除相对分子量小于100的杂质，同时实现对谷胱甘肽的浓缩。由于谷胱甘肽相对分子量为307.33，因此通过精心设定的超滤和纳滤处理，不仅能有效去除干扰谷胱甘肽分离纯化的杂质，而且谷胱甘肽的损失少、处理成本低。其次，为了进一步消除杂质对谷胱甘肽与离子交换树脂相互作用的干扰，本项目采用独有的扩张床亲和层析技术进行谷胱甘肽的特异性纯化，采用亲和选择性更高、亲和力更强的亲和层析来替代传统的离子交换层析来彻底解决杂质干扰的问题。由于传统的固定床亲和层析存在处理规模小、处理效率低的不足，本项目还将亲和层析与扩张床进行耦合，利用扩张床独具的上样量大、洗脱浓度高的优点，设计了新颖的扩张床亲和吸附层析工艺，使谷胱甘肽吸附的效率、回收率和纯化纯度等指标都同时得到了显著改善，一次吸附和洗脱可以从料液中回收超过80％以上的谷胱甘肽。洗脱液经纳滤浓缩、乙醇沉淀结晶、真空干燥后得谷胱甘肽成品，产品纯度大于90％。2.如权利要求1中(1)所诉，其特征在于加入两性生物絮凝剂对亲水性和亲脂性色素和苦味物质进行同时吸附。3.如权利要求1中(2)所诉，其特征在于采用酶工程技术获得的新型蛋白酶