高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112143751A(43)申请公布日2020.12.29(21)申请号202011003905.6C12P19/40(2006.01)(22)申请日2020.09.22C12N1/21(2006.01)C12R1/125(2006.01)(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市经济技术开发区华祥路66号(72)发明人孙莹莹胡丹白立宽吴涛(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.C12N15/75(2006.01)C12N15/90(2006.01)C12N15/67(2006.01)C12N15/52(2006.01)C12N15/60(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表15页附图1页(54)发明名称高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明提供高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法与应用。本发明还提供发酵生产核苷的方法，包括：(1)增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_009967365.1的谷氨酸合酶基因gltA；和/或增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_003231737.1的谷氨酰胺合成酶基因glnA；(2)将步骤(1)获得的基因增强菌株用于核苷的发酵生产。本发明提供的枯草芽孢杆菌工程菌为核苷高产菌株，能有效积累核苷，提高核苷的产量，为核苷的工业化生产奠定了基础。CN112143751ACN112143751A权利要求书1/2页1.发酵生产核苷的方法或提高核苷发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)增强枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)染色体上编码NCBI参考序列WP_009967365.1的谷氨酸合酶基因gltA；和/或增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_003231737.1的谷氨酰胺合成酶基因glnA；(2)将步骤(1)获得的基因增强菌株用于核苷的发酵生产。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，增强的途径选自以下1)～3)，或任选的组合：1)通过点突变而增强；2)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；3)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过点突变增强谷氨酸合酶基因gltA，使其编码的谷氨酸合酶的第1181位丙氨酸突变为缬氨酸；和/或通过将强启动子与谷氨酸合酶基因gltA可操作地连接而增强；和/或通过将强启动子与谷氨酰胺合成酶基因glnA可操作地连接而增强；优选地，所述强启动子为来自枯草芽孢杆菌cdd基因的P43。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilisA5。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述核苷选自腺苷、肌苷、鸟苷和黄苷中的至少一种。6.高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_009967365.1的谷氨酸合酶基因gltA和/或编码NCBI参考序列WP_003231737.1的谷氨酰胺合成酶基因glnA，获得的基因增强菌株；优选地，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilisA5。7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，增强的途径选自以下a)～c)，或任选的组合：a)通过点突变增强谷氨酸合酶基因gltA，使其编码的谷氨酸合酶的第1181位丙氨酸突变为缬氨酸；b)通过将强启动子与谷氨酸合酶基因gltA可操作地连接；c)通过将强启动子与谷氨酰胺合成酶基因glnA可操作地连接；优选地，所述强启动子为来自枯草芽孢杆菌cdd基因的P43。8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，增强的途径为a)和c)组合。9.高产核苷的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段增强枯草芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_009967365.1的谷氨酸合酶基因gltA和/或编码NCBI参考序列WP_003231737.1的谷氨酰胺合成酶基因glnA，获得基因增强菌株；增强的途径选自以下a)～c)，或任选的组合：a)通过点突变增强谷氨酸合酶基因gltA，使其编码的谷氨酸合酶的第1181位丙氨酸突变为缬氨酸；b)通过将强启动子与谷氨酸合酶基因gltA可操作地连接；c)通过将强启动子与谷氨酰胺合成酶基因glnA可操作地连接；2CN112143751A权利要求书2/2页优选地，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilisA5；所述强启动子优选来自枯草芽孢杆菌cdd基因的P43启动子。10.权利要求6-8任一项所述的工程菌或按照权利要求9所述方法构建的工程菌在发酵生产核苷中的应用；所述核