高产鸟苷的工程菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112574934A(43)申请公布日2021.03.30(21)申请号202011086294.6C12R1/07(2006.01)(22)申请日2020.10.12(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市经济技术开发区华祥路66号(72)发明人薛婷莉胡丹李鑫磊吴涛(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/52(2006.01)C12N15/53(2006.01)C12P19/40(2006.01)C12R1/125(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表8页(54)发明名称高产鸟苷的工程菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明提供高产鸟苷的工程菌及其构建方法与应用。本发明还提供发酵生产嘌呤核苷的方法，包括：1)改造细菌染色体上编码NCBI参考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的GMP合成酶基因，使其编码的GMP合成酶的第234位缬氨酸被其他氨基酸取代，导致该酶活性增强；和/或2)改造细菌染色体上编码NCBI参考序列WP_013353436.1的GMP还原酶基因，使其编码的GMP还原酶的第8位谷氨酸突变为终止密码子，导致该酶活性减弱或失活；以及3)用步骤1)和/或步骤2)改造得到的细菌发酵生产嘌呤核苷；所述细菌是具有嘌呤核苷生产能力的微生物。包含上述两种突变的微生物可用于发酵生产鸟苷并提高鸟苷发酵产量。CN112574934ACN112574934A权利要求书1/2页1.发酵生产嘌呤核苷的方法或提高嘌呤核苷发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)改造细菌染色体上编码NCBI参考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的GMP合成酶基因，使其编码的GMP合成酶的第234位缬氨酸被其他氨基酸取代，导致该酶活性增强；和/或(2)改造细菌染色体上编码NCBI参考序列WP_013353436.1的GMP还原酶基因，使其编码的GMP还原酶的第8位谷氨酸突变为终止密码子，导致该酶活性减弱或失活；以及(3)用步骤(1)和/或步骤(2)改造得到的细菌发酵生产嘌呤核苷；其中，所述细菌是具有嘌呤核苷生产能力的微生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嘌呤核苷为鸟苷。4.根据权利要求1‑3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述其他氨基酸为异亮氨酸。5.高产鸟苷的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过增强原始菌株中编码NCBI参考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的基因，获得的基因增强菌株；和/或所述工程菌是通过弱化原始菌株中编码NCBI参考序列WP_013353436.1的基因，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；其中，所述原始菌株是具有嘌呤核苷生产能力的微生物。6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，改造枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的GMP合成酶基因，使其编码的GMP合成酶的第234位缬氨酸被异亮氨酸取代，导致该酶活性增强；和/或改造枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_013353436.1的GMP还原酶基因，使其编码的GMP还原酶的第8位谷氨酸突变为终止密码子，导致该酶活性减弱或失活。7.高产鸟苷的工程菌的构建方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段增强原始菌株中编码NCBI参考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的基因，获得基因增强菌株；和/或利用基因工程手段弱化原始菌株中编码NCBI参考序列WP_013353436.1的基因，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达；其中，所述原始菌株是具有嘌呤核苷生产能力的微生物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，改造枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_038462632.1或WP_014469845.1的GMP合成酶基因，使其编码的GMP合成酶的第234位缬氨酸被异亮氨酸取代，导致该酶活性增强；和/或改造枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌染色体上编码NCBI参考序列WP_013353436.1的GMP还原酶基因，使其编码的GMP还原酶的第8位谷氨酸突变为终止密码子，导致该酶活性减弱或失活。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，