一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103215217A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103215217103215217A(43)申请公布日2013.07.24(21)申请号201310099817.4(22)申请日2013.03.26(71)申请人中国科学院过程工程研究所地址100190北京市海淀区中关村北二条1号(72)发明人马光辉周炜清康跻耀张贵峰苏志国孙李靖李娟(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332代理人巩克栋(51)Int.Cl.C12N5/02(2006.01)C08J9/36(2006.01)C12N5/07(2010.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书7页说明书7页附图5页附图5页(54)发明名称一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体及其制备方法。本发明的微载体以魔芋葡甘聚糖微球为基质，用胶原蛋白覆层微球。本发明的微载体的制备方法如下：将基质微球中加入活化试剂与催化剂，在碱性环境下进行活化反应；将上步制备的微球清洗抽干后，加入缓冲液中，加入胶原蛋白，进行偶联反应；反应完毕的体系混匀后，加入水中，胶原蛋白在微球表面覆层凝聚，然后清洗微球；将微球加入反应容器中，再加入交联试剂与PBS缓冲液，搅拌使其反应，反应完毕清洗后即得微载体产品。该微载体表面蛋白覆盖均匀，连接牢固，利于细胞的快速贴附和高密度生长；且制成的微载体成本低廉，周期较短，有利于工业化生产。CN103215217ACN103257ACN103215217A权利要求书1/2页1.一种胶原蛋白覆层微载体，其特征在于，所述微载体的基质为魔芋葡甘聚糖微球，胶原蛋白的覆层量为基质微球质量的1%-10%，覆层的胶原蛋白通过活化试剂与基质微球共价偶联。2.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述的基质微球的粒径为50-500μm，优选为100-300μm，进一步优选160-250μm；优选地，所述的基质微球含水量为80%以上；优选地，所述的胶原蛋白为猪明胶、鱼明胶、牛明胶或其混合物；优选地，所述的胶原蛋白分子量为3,000-50,000，优选5,000-50,000，进一步优选5,000-20,000；优选地，所述的活化试剂为含环氧基团的长链试剂，优选长链试剂至少含有6个碳原子，进一步优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或其混合物。3.根据权利要求1或2所述的微载体的制备方法，包括如下步骤：a)在魔芋葡甘聚糖微球中加入活化试剂与催化剂，在碱性环境下进行活化反应，得到活化的魔芋葡甘聚糖微球；b)将步骤a)得到的所述微球清洗抽干后，加入NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入胶原蛋白，进行偶联反应；c)将步骤b)反应完毕的体系混匀后，加入水中，胶原蛋白在微球表面覆层凝聚后，清洗微球；d)将步骤c)处理好的微球加入反应容器中，再加入交联试剂与PBS缓冲液，搅拌使其反应，反应完毕清洗后即得所述的微载体产品。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述的活化试剂为含环氧基团的长链试剂，优选长链试剂至少含有6个碳原子，进一步优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或其混合物；优选地，所述活化剂的用量为1-10mmol/g微球；优选地，所述的催化剂为硼氢化钠，优选其加入量为0.5-50mg/g微球，进一步优选0.5-25mg/g微球；优选地，所述的碱性环境由阳离子为碱金属离子，阴离子为氢氧根离子的碱性溶液提供，优选为NaOH或KOH溶液；优选地，所述碱性溶液浓度为0.1-3M，优选0.5-3M，进一步优选0.5-2M；优选地，所述的碱性溶液的加入量为0.5-5mL/g微球；优选地，所述活化反应的活化温度为15-65℃，优选25-65℃；优选地，所述活化反应的反应时间为0.5-24h，优选为0.5-10h，进一步优选为3-6h。5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述的NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为8-12，优选9-12，进一步优选10-12；优选地，所述偶联反应的反应温度为15-65℃，优选30-65℃；优选地，所述偶联反应的反应时间为0.5-24h，优选为0.5-10h，进一步优选为3-6h。6.根据权利要求3-5之一所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中所述的水为0-10℃的水，优选为0-10℃的去离子水；2CN103215217A权利要求书2/2页优选地，所述的水的加入量为5-100mL/g微球。7.根据权利要求3-6之一所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中所述的交联试剂为双醛基类、双环氧类、二亚胺类