一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105463049A(43)申请公布日2016.04.06(21)申请号201510894990.2C12R1/01(2006.01)C12R1/07(2006.01)(22)申请日2015.12.07(71)申请人陕西科技大学地址710021陕西省西安市未央区大学园1号(72)发明人毛跟年贾莹张诗韵许牡丹(74)专利代理机构西安通大专利代理有限责任公司61200代理人岳培华(51)Int.Cl.C12P39/00(2006.01)C12P21/00(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/30(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/16(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图2页(54)发明名称一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法(57)摘要本发明提供了一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，以魔芋飞粉为原料，通过耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共发酵制备魔芋多肽；采用硫酸铵分级沉淀法提取魔芋多肽中可溶性糖肽；然后将透析除盐后的粗糖肽依次通过DEAE-纤维素柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化；最后采用亲和层析的方法得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。本发明填补了以魔芋飞粉为原料结合发酵法、硫酸铵分级沉淀和色谱技术制备魔芋甘露聚糖肽的技术空白，同时也为魔芋飞粉的开发利用，生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。CN105463049ACN105463049A权利要求书1/2页1.一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)发酵：向每100mL培养基中加入魔芋飞粉1～4g，采用耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共生发酵，发酵完成后，发酵液经离心后去除菌体，取上清液，向其中加入1～5倍于上清液体积的纯化水，然后用三氯乙酸调节pH值至3.8～4.2，静置后去除沉淀，去除沉淀后得到的上清液即为魔芋糖肽液；2)硫酸铵分级沉淀：向魔芋糖肽液中加入硫酸铵晶体，使硫酸铵的饱和度达到20～80％，然后静置、离心，离心得到的沉淀用pH＝7～9的Tris-Hcl缓冲液溶解，再经透析后得到可溶性糖肽；3)用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-100凝胶柱层析依次对可溶性糖肽进行分离纯化，得到魔芋甘露聚糖肽粗品；4)将魔芋甘露聚糖肽粗品进行ConA-Sepharose4B亲和柱层析，即得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。2.根据权利要求1所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的发酵工艺为：培养基的pH值为7.0～11.0，耐热解蛋白芽孢杆菌与短小芽孢杆菌的菌种比例为1:(1～3)，使用的菌液浓度为5×107～5×109个/mL，接种量为4～12％，发酵温度为25～38℃，发酵时间为24～48h。3.根据权利要求1所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的培养基是向每100mL蒸馏水中加入蛋白胨1g、牛肉膏1.5g、NaNO30.08～0.39g、K2HPO40.04～0.25g、KCl0.01～0.12g、MgSO4·7H2O0.01～0.12g和FeSO40.001～0.01g后得到的。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的发酵液在4℃下以8000～12000r/min的转速离心10～30min后去除菌体。5.根据权利要求1-3中任意一项所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的静置是在-4℃下静置10～20min，离心是在4℃及8000～12000r/min的转速下离心10～30min。6.根据权利要求1-3中任意一项所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的DEAE-52纤维素柱层析条件为：层析柱规格为(1～20)cm×(20～80)cm，上样量为1～500mL，依次用蒸馏水、0.05～0.15mol/L的NaHCO3溶液梯度洗脱，洗脱流速为0.5～80mL/min，每管收集2～4min，检测波长为280nm和490nm，合并同时具有糖、肽吸收峰的组分，浓缩、透析后备用。7.根据权利要求1-3中任意一项所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的SephadexG-100凝胶柱层析条件为：层析柱规格为(1～20)cm×(50～120)cm，上样量为3～350mL，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为0.5～180mL/min，每管收集3～6min，检测波长为280nm和490nm，合并同时具有糖、肽吸收峰的组分，再经浓缩、透析、乙醇沉淀干燥后得到魔芋甘露聚糖肽粗品。8.根据权利要求1-3中任意一项所述的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中的ConA-Sepha