一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109122317A(43)申请公布日2019.01.04(21)申请号201810990469.2(22)申请日2018.08.28(71)申请人江苏高航农业科技有限公司地址222002江苏省连云港市高新区花果山大道17号楼108室(72)发明人张金博(74)专利代理机构长沙新裕知识产权代理有限公司43210代理人赵登高(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)A01H1/08(2006.01)权利要求书2页说明书6页(54)发明名称一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法(57)摘要本发明提供了一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法，该脱毒方法详细步骤包括：S1、彩色马蹄莲花蕾的取材与预处理；S2、花蕾消毒与花药预处理；S3、花药接种与诱导培养；S4、愈伤组织增殖培养；S5、愈伤组织分化培养；S6、水培生根；S7、炼苗与移栽；S8、彩色马蹄莲非二倍体植株的剔除。本发明的脱毒原理是通过花药培养途径获得了彩色马蹄莲花粉植株，花粉植株几乎不含病毒，再剔除花培群体中的非二倍体杂株，从而获得脱毒的彩色马蹄莲正常倍性植株。本发明操作简便，脱毒效果显著，可以极大的提升彩色马蹄莲的品质和产量。CN109122317ACN109122317A权利要求书1/2页1.一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法，其特征在于，该脱毒方法的详细步骤如下：S1、彩色马蹄莲花蕾的取材与预处理在11月~12月彩色马蹄莲现蕾时期，选择晴天上午取材，将摘得的花蕾装入冰壶中带回实验室，筛选花粉小孢子处于单核靠边期的花蕾，置于32℃热激处理2d；S2、花蕾消毒与花药预处理将上述花蕾用自来水冲洗20~30min，置于超净工作台中，先用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗2~3次，再用0.1%升汞+2~3滴吐温-80浸泡8min，用无菌水冲洗3~4次；在解剖镜下用镊子拨开花蕾取出花药放在0.2mol/L的甘露醇溶液中预处理3d；S3、花药接种与诱导培养将上述预处理后的花药用无菌滤纸吸干表面多余的液体，然后接种在诱导培养基上，每瓶培养基接种40~50枚花药，置于温度24~26℃，相对湿度65~75%的黑暗条件下培养，培养48~60d可诱导出淡黄色的愈伤组织；S4、愈伤组织增殖培养将步骤S3获得的愈伤组织转接到增殖培养基上继续培养，每30d继代一次，继代2~4次后可获得大量的愈伤组织；培养条件控制为温度24~26℃，相对湿度65~75%，光照强度1500~2000Lux，光照10h/d；S5、愈伤组织分化培养无菌条件下将上述获得的愈伤组织分别转接到分化培养基上，置于23~27℃、相对湿度65~75%、光照强度1800~2200Lux、光照12~14h/d的培养条件下进行愈伤组织分化培养，培养28~34d后愈伤组织分化出不定芽；S6、水培生根待步骤S5中分化出的不定芽长到1.5~2.0cm时，将小芽从愈伤组织上切下，接种到生根培养液中，进行水培生根；培养条件控制为温度22~25℃、相对湿度60~80%、光照强度2500~3000Lux、光照15~17h/d，培养22~28d可得到长出5~8条根系的彩色马蹄莲幼苗；S7、炼苗与移栽待彩色马蹄莲幼苗长到10cm左右时，将组培瓶移到温室大棚中，大棚的温度控制在20~27℃、湿度控制在80%~90%，将组培瓶的瓶口打开，在自然光光照的条件下炼苗5~7d；将幼苗从组培瓶中取出，移栽入大棚的栽培基质中，定期浇水和营养液，进行常规栽培管理；S8、彩色马蹄莲非二倍体植株的剔除移栽后的彩色马蹄莲幼苗生长到现蕾期时，将非二倍体植株剔除，剩余的则为彩色马蹄莲正常二倍体植株。2.根据权利要求1所述的一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法，其特征在于，所述步骤S1中筛选花蕾的方法为：将花蕾中的花药挑取2~4枚碾碎，释放出花粉，用DAPI染色后镜检确认小孢子发育时期为单核靠边期。3.根据权利要求1所述的一种彩色马蹄莲的高效脱毒方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中诱导培养基的配方为：KNO31500~1800mg/L，（NH4）2SO4415~445mg/L，KH2PO4180~240mg/L，MgSO4·7H2O203~215mg/L，Ca（NO3）2310~330mg/L，MnSO4·4H2O7~9mg/L，ZnSO4·7H2O4.4~5.0mg/L，H3BO30.6~1.0mg/L，KI1.1~1.5mg/L，CoCl2·6H2O0.022~0.026mg/L，Na2MoO4·2H2O0.2~0.3mg/L，FeSO4·7H2O26.5~28.5mg/L，Na2-EDTA37.3~2CN109122317A权利要求书2/2页38.5mg/L，肌醇85~95mg/L，甘氨酸3.0~4.0mg/L，L-天