蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105624334A(43)申请公布日2016.06.01(21)申请号201610134738.6(22)申请日2016.04.18(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350001福建省福州市湖东路312号国检广场(72)发明人张体银郑腾蔡一龙白泉阳王武军张志灯于师宇(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图3页(54)发明名称蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明涉及蜜蜂以色列急性麻痹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒的检测。该试剂盒包括：（1）反转录预混液；（2）PCR预混液；（3）反转录酶；（4）TaqDNA聚合酶；（5）阳性对照；（6）阴性对照；（7）RNase-freeddH2O。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜜蜂IAPV的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；2）灵敏度高：灵敏度能达到103拷贝；3）操作简便：采用反应预混液，减少操作步骤，降低污染风险。本方法可用于蜜蜂的IAPV感染检测，对该病的早期预防和及时防治具有重要意义。CN105624334ACN105624334A权利要求书1/1页1.一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列为5’-AAGGCTCAGCTAGGATGACAC-3’，反向引物序列为5’-TCAGGATTTAAAGCCTCACG-3’。2.根据权利要求1的蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：（1）反转录预混液：，每个20μL反应体系包括5×反转录Buffer4μL；浓度为10μmol/L的反向引物1μL；5mmol/L的dNTP2μL；25mmol/L的MgCl22μL；40U/μLRNA酶抑制因子0.5μL，共9.5μL；（2）PCR预混液：每个25μL反应体系包括2×PCRBuffer12.5μL；浓度为10μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL；5mmol/L的dNTP1μL；25mmol/L的MgCl22μL，共16.5μL；（3）反转录酶：200U/μL；（4）TaqDNA聚合酶：5U/μL；（5）阳性对照：将扩增的目的片段产物连接至克隆载体，转化大肠杆菌制备的感受态细胞获得阳性的克隆菌株；（6）阴性对照：采用无以色列急性麻痹病毒感染的健康蜜蜂组织提取的总RNA作为阴性对照；（7）RNase-freeddH2O。3.利用权利要求1或2所述的蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA3μL，RNase-freeddH2O7μL，70℃孵育10min，短暂离心后冰浴5min，再加入反转录反应液9.5μL和浓度为200U/μL反转录酶0.5μL；在42℃孵育60min，95℃5min灭活反转录酶，冰浴5min，合成cDNA；（2）PCR反应：在PCR管中加入PCR反应液16.5μL，步骤（1）合成的cDNA3μL，5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，RNase-freeddH2O5μL，总体积为25μL；PCR反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸10min，反应结束；（3）PCR扩增产物电泳检测：取步骤（2）PCR扩增产物10μL用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，恒压5V/cm～8V/cm，电泳30min～60min；溴化乙锭染色30min后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果，阳性目的条带大小为270bp。2CN105624334A说明书1/4页蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物检疫技术领域，适用于进出境蜜蜂及其蜜蜂养殖企业以色列急性麻痹病毒的快速检测和监测。背景技术[0002]2006年冬季到2007年春季，蜂群崩溃失调病(colonycollapsedisorder，简称CCD)席卷了美国的22个州，随后相继在法国、瑞典、德国和澳大利亚等国家流行，致使当地蜂农蜂群损失达50%～90%。经调查发现以色列急性麻痹病毒（Israelacuteparalysisvirus，IAPV）在有CCD症状蜂群里存在的概率为83.3%，而