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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108402086A(43)申请公布日2018.08.17(21)申请号201810129864.1(22)申请日2018.02.08(71)申请人金华市艾力生物科技有限公司地址321022浙江省金华市金华山旅游经济区赤松镇石下村(72)发明人周艳初(74)专利代理机构北京华识知识产权代理有限公司11530代理人赵永强(51)Int.Cl.A01N63/02(2006.01)A01P21/00(2006.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称从天然树脂中提取活性成分的方法(57)摘要本发明公开了从天然树脂中提取活性成分的方法,包括:预处理、高效液相色谱分离,将蜂胶经冷冻后粉碎,加入乙醇溶液后置于超声波清洗器中超声提取,收集提取液稀释后过微孔膜得滤液,将滤液经高效液相色谱分离得活性成分。本发明还公开了从天然树脂中提取出的活性成分作为一种人参活性成分的刺激物应用于人参培养。有益效果为:本发明方法不仅可以大大增强蜂胶中黄酮类活性成分的溶出,同时又可有效防止黄酮类物质的挥发与讲解,提高产物活性组分中黄酮物质的含量,提高提取效果与活性成分的含量,蜂胶活性成分可以刺激种胚细胞人参皂苷的合成,能够提高皂苷含量。CN108402086ACN108402086A权利要求书1/1页1.从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述从天然树脂中提取活性成分的方法包括:预处理:将蜂胶样品放入冰箱,在-30~-40℃温度下冷冻60-90分钟,粉碎后过20-60目筛,称取蜂胶粉于容器中,加入15-20倍75-95%的乙醇溶液,置于双频率超声波清洗器中超声1-2小时,然后水浴摇床提取,提取结束后,离心收集蜂胶提取液,然后稀释8-10倍,经0.20-0.22μm微孔膜过滤得滤液,待用;高效液相色谱分离:将滤液经高效液相色谱分离,选用色谱柱的规格为250×4.6mm、5μm,柱温箱温度为33-35℃,检测波长为340nm与280nm,进样量为8-10u1,选用流动相为:B相为甲醇,A相为水;收集洗脱组分合并即为活性成分。2.根据权利要求1所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述预处理步骤中的乙醇溶液中含有0.6-0.8‰的(S)-4-苄基-2-噁唑酮和0.1-0.12‰的(R)-4-苄基-2-噁唑酮。3.根据权利要求1所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述预处理步骤中,双频率超声波的超声频率与声强密度分别为30-40kHz、0.35-0.45W/cm2与50-60kHz、0.45-0.60W/cm2,超声时溶液温度为23-25℃。4.根据权利要求1所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述预处理步骤中,水浴摇床提取温度为42-46℃,摇床转速为120-150r/min,提取时间为12-15小时。5.根据权利要求1所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述高效液相色谱分离步骤中,流动相B相甲醇中含有0.08-0.1%的甲酸,A相水中含有0.08-0.1%的甲酸。6.根据权利要求1所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述高效液相色谱分离步骤中,梯度洗脱程序如下:0-25min,22-36%B;25-55min,36-52%B;55-90min,52-63%B;90-115min,63-70%B;115-135min,70-75%B;135-150min,75-80%B;流速为1-1.5mL/min。7.根据权利要求1所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述蜂胶活性成分可以作为一种人参活性成分的刺激物应用于人参培养,具体操作步骤为:将人参种子灭菌消毒后去掉硬种皮外壳,解剖并取出胚,将取出的人参种胚置于预培养基上预培养,预培养条件为:每日日光灯光照12-14小时、室温24-26℃;培养15-18天后,将变成绿色的人参胚转到愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤,诱导培养条件为:黑暗、室温24-26℃;诱导培养50-60天后将诱导出的生长旺盛的愈伤组织分离出来,接种到新配置的继代培养基上培养,继代培养条件为:黑暗、室温24-26℃,在继代培养的第5-7天加入蜂胶提取分离物,添加量为0.3-0.4mg/100g培养基。8.根据权利要求7所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述人参种胚预培养基为:MS基本培养基、2-2.5mg/L6-BA、0.5-0.6mg/LNAA、30-35g/L蔗糖、8-10‰琼脂,pH值为5.8-6.0。9.根据权利要求7所述的从天然树脂中提取活性成分的方法,其特征在于:所述继代培养基与愈伤组织诱导培养基组成为:MS基本培养基、3-3.2mg/